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D-丙氨酸是一种重要的手性中间体,广泛应用在食品、化妆品、生理医学、生物制药等方面。丙氨酸脱氢酶和丙氨酸消旋酶是细菌细胞壁肽聚糖层中D-丙氨酸合成和代谢的关键酶蛋白,也是潜在的工业生产D-丙氨酸的生物合成元器件,本文以嗜碱芽孢杆菌OF4和腾冲嗜热厌氧菌来源的丙氨酸脱氢酶(OF4Ald)及丙氨酸消旋酶(MBalr、OF4dadX)为研究对象,基于三维结构解析、结构模拟、定点突变技术及酶学特性表征,探究酶蛋白关键位点的作用机理及酶蛋白的催化机制,为改造并获得具有高活性和高稳定性的D-丙氨酸生物合成元器件提供理论基础。通过同源序列比对,发现嗜碱芽孢杆菌(Bacillus pseudofirmus)OF4中丙氨酸脱氢酶可能存在5个高度保守的活性中心:R15、K73、K75、H96和D269,通过定点突变并检测酶蛋白活性,突变体R15A、K75A、H96A和D269A完全丧失了活性,推测这4个位点可能是丙氨酸脱氢酶的活性位点;然而K73A的相对活性约是野生型的两倍,将该位点分别突变为K73E、K73F、K73Q、K73S、K73R和K73Y,通过测定突变体的动力学参数,并结合同源结构模拟技术,最终发现K73位点通过氢键与K75相互作用影响了酶蛋白与底物的结合:当氢键存在时,酶蛋白与底物亲和力弱;当氢键作用消失,酶蛋白与底物亲和力强。根据文献报道,丙氨酸消旋酶底物通道存在8个高度保守的氨基酸位点,然而,来自腾冲嗜热厌氧菌(Thermoanaerobacter tengcongensis)MB4的生物合成型丙氨酸消旋酶中只存在6个保守位点,其余2个为不保守氨基酸。为了探究不保守位点的作用机理,分别通过定点突变技术将该位点替换为保守的氨基酸残基:S173D和Q360Y,检测其酶学特性发现:突变体Q360Y的催化效率是野生型的17.83倍,说明该位点可能是影响酶蛋白催化活性的关键位点;虽然S173D的催化效率仅为野生型的80%,但是该突变体的最适反应温度为80℃,比野生型高了 15℃;通过半饱和突变对S173位点进一步研究发现,该位点突变后酶蛋白的最适反应温度均比野生型提高了 5-15℃,说明该位点是影响酶蛋白最适反应温度的关键位点。实验还探究了 MBalr底物通道内层保守位点A172与S173和Q360之间的相互作用,在基于突变体S173D、Q360H和Q360Y的基础上,通过定点突变技术分别构建了 2点突变体和3点突变体,酶学特性分析发现:A172突变为S172后导致突变体酶蛋白相对活性有所提高(3.16%-11.92%),但是这些突变体的稳定性变差;Q360突变后能够提高酶蛋白活性,但采用不同的氨基酸替代其稳定性也存在差异;S173则通过牺牲酶蛋白催化活性来提升其稳定性。总之,Q360位点可参与调节丙氨酸消旋酶的活性,S173位点可参与调控消旋酶的稳定性,而S173和Q360位点还与消旋底物的选择性有关。基于嗜碱芽孢杆菌丙氨酸消旋酶OF4dadX的三维结构分析结果,发现丙氨酸消旋酶二聚体界面上存在五个参与盐键形成的氨基酸位点D43、D70、E71、E134和D318。为了探究这五个位点的作用机理,通过定点突变技术分别替换为赖氨酸(K)以破坏盐键作用,并测定突变体的相对酶活和酶蛋白低聚合状态,实验发现D43K、D70K与野生型的相对酶活和低聚合状态相似(二聚体);而E71K、E134K、D318K基本丧失了活性,且相对分子量约为45.7-48.9kDa,与OF4dadX单体分子量接近,说明E71、E134和D318这三个位点所形成的盐键可能参与OF4dadX二聚化、维持二聚体结构和空间构型,突变后则导致酶蛋白以单体形式存在,酶蛋白催化活性丧失。