目的阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)亦称老年性痴呆(senile dementia),是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。该病起病隐袭,病程呈进行性进展,以渐进性学习记忆、认知功能减退、行为异常、日常生活能力下降及情感、思维障碍等为主要临床表现。其典型的病理改变是神经细胞间出现大量以p-淀粉样肽(β-Amyloid, Aβ)为核心的老年斑(senile plaques, SP)、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)及神经元的丢失等。AD的发病机制目前尚未完全阐明,但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受人们的关注。自由基形成和氧化应激增强,进一步引起神经细胞凋亡,是导致AD的功能退化和神经变性的基础。p75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor, P75NTR)是神经营养素的低亲和力受体,与AD神经元细胞凋亡有关。TrkA即酪氨酸激酶A (tyrosine kinase A)是神经营养素的特异性受体,与神经元细胞分化、生长、修复、存活密切有关。p75NTR诱导凋亡的信号通路目前仍不十分清楚,但已广泛公认的是其对c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase, JNK)的激活是介导神经元细胞凋亡的关键步骤,并进一步通过激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表达,促进或引起细胞凋亡。此外,JNK还能通过诱导细胞色素C的释放进一步活化Caspase-3而导致细胞凋亡。TrkA对神经元发挥促进其分化、生长、存活功能的机制研究的相对比较透彻,其主要通过激活Ras-MAPK-ERK信号转导通路,特别是通过活化的Erkl/2信号转导通路来实现。研究并建立可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治药物的研发均有重要的意义。到目前为止用于AD研究的动物模型很多,其中转基因模型是一种病因模型,过量表达人源性突变AD相关基因的转基因鼠,因其具有明确的病因,并能反映AD的部分病理与功能变化,有助于我们了解AD的发病机制,也逐渐成为研究AD的最为理想的整体模型。防治AD的抗氧化剂及抗凋亡药物的研究与开发成为当今药理学研究领域的重要课题之一。(-)表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是绿茶的一种主要多酚成分,研究证实绿茶有效的铁螯和、抗氧化、抗炎、抗癌及神经保护等作用的发挥主要依赖于EGCG。Levites等人通过研究人类成神经细胞瘤SHSY5Y细胞和大鼠成纤维细胞瘤PC12细胞,发现EGCG能够减少具有神经毒性作用的Ap的产生。因此,本研究拟通过遗传性的APP/PS1转基因小鼠,采用Nissl、TUNEL染色、免疫组化、Western blot等方法研究APP/PS1转基因小鼠认知行为、病理改变、抗氧化能力、细胞凋亡、Aβ(1-40)、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor Protein, APP)、促凋亡蛋白caspase-3及P75-JNK-P53凋亡相关通路及抗凋亡蛋白Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1相关通路的影响,即9月龄的APP/PS1转基因小鼠上述指标的改变,同时进一步探讨EGCG对APP/PS1转基因小鼠模型的神经保护作用及其作用机制。材料与方法APP/PS1转基因小鼠实验取C57小鼠10只及APP/PS1小鼠22只,C57小鼠为对照组(Control)、APP/PS1小鼠22只随机分为模型组(APP/PS1)和实验组(APP/PS1+2 mg/kg EGCG)。实验组APP/PS1转基因小鼠按2 mg/kg的剂量灌胃0.04%的EGCG,每日一次,连续灌胃4周；对照组及模型组小鼠灌胃等量的双蒸水,每日一次,连续灌胃4周。最后一周对小鼠进行水迷宫、避暗及自主活动等行为学检测,其间继续给药。行为学结束后,快速取一部分小鼠脑组织入-80℃低温冰箱中冻存,分别进行SOD、GSH-Px、AChE酶活性、MDA含量的测定及Western blot印迹分析APP、caspase-3、NGF、P75、JNK2、P53、Phospho-TrkA.Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1、CREB等蛋白表达水平的实验。另一部分小鼠进行灌流固定,取脑后分别进行HE染色、Nissl染色、TUNEL染色及Aβ(1-40)、caspase-3、APP、CREB、TrkA等免疫组化的检测分析。实验结果1、EGCG对APP/PS1转基因小鼠记忆及判断能力的影响水迷宫、避暗、自主活动等行为学结果显示APP/PS1转基因小鼠出现明显的学习记忆及判断能力的下降,但活动能力未受影响。EGCG明显的改善了APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍,提高了小鼠的记忆与判断能力。2、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑组织病理改变的影响HE染色及Nissl染色结果显示,APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区神经元数量明显减少,细胞排列松散,细胞核固缩、染色质边集和核碎裂,尼氏体分界不清,排列紊乱、松散,细胞周围出现间隙,其中许多细胞胞体缩小、胞浆呈淡红色、胞核固缩,可见坏死的神经元；EGCG明显的减轻了APP/PS1转基因小鼠脑内神经元损伤程度,细胞排列相对整齐,细胞形态规则,层次丰富,核仁清晰。3、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ(1-40)蛋白表达的影响Aβ(1-40)蛋白免疫组化染色结果显示：APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的Aβ(1-40)蛋白表达水平显著增高；EGCG能明显抑制小鼠大脑皮层及海马区的Aβ(1-40)蛋白表达水平。4、EGCG对APP/PS1转基因小鼠海马区SOD、GSH-Px及AChE酶活性及MDA含量的影响酶学结果显示APP/PS1转基因小鼠海马内SOD、GSH-Px活性明显降低,AchE酶活性及MDA含量明显升高；EGCG能明显的提高小鼠海马内SOD、GSH-Px酶活性,并明显的降低MDA含量和AchE酶的活性。5、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑区神经元细胞凋亡的影响TUNEL法染色结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区可见有较多的凋亡细胞,且细胞凋亡指数与空白对照组比明显增多；EGCG能明显的减少APP/PS1转基因小鼠大脑内神经元细胞的凋亡6、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内CREB蛋白表达的影响CREB免疫组化染色及Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的CREB蛋白表达水平明显降低：EGCG明显的提高了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的CREB蛋白表达水平。7、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白表达的影响APP免疫组化染色及Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平明显增高；EGCG明显的抑制了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平的增高。8、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内内P75NTR、JNK2及P53蛋白表达的影响Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因脑内海马内P75蛋白的表达水平增高,同时海马区JNK2及P53蛋白表达水平增加；EGCG可明显的抑制p75ICD、JNK2及P53蛋白表达水平。9、EGCG对APP/PS1转基因小鼠脑内内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1蛋白表达的影响Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因小鼠脑内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1蛋白的表达水平降低；EGCG可明显的提高APP/PS1转基因小鼠脑内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1等蛋白表达水平。结论1、EGCG能够改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。2、EGCG能够提高APP/PS1转基因小鼠脑内内的抗氧化酶活性,及降低AchE酶的活性,发挥有效的抗氧化作用及增强记忆能力的作用。3、EGCG通过抑制APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内的APP及Aβ(1-40)蛋白水平,对神经细胞发挥一定的保护作用。4、EGCG通过抑制APP/PS1转基因小鼠脑内内p75ICD、JNK2及P53凋亡通路相关蛋白表达水平,进一步抑制caspase-3蛋白活性,对神经细胞发挥有效的抗凋亡作用。5、EGCG通过促进APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内的Trka及CREB蛋白水平,对神经细胞发挥一定的保护作用。6、EGCG通过提高APP/PS1转基因小鼠脑内内Phospho-c-raf、Phospho-MEK1/2、Phospho-ERK1/2、Phospho-p90RSK、Phospho-MSK1抗凋亡通路相关蛋白表达水平,对神经细胞发挥有效的抑制凋亡的作用。