世界卫生组织统计在2004年新感染HIV人数有490万,HIV-1感染者已经达到3900万人,其中包括进展为艾滋病的人数,有310万人死于艾滋病相关疾病。联合国2006年报告显示,自1981年起全球累计感染HIV/AIDS人数超过6500万人。在发达国家,高效抗逆转录疗法(highly active antiretroviral therapy,HAART)的使用积极有效地遏制住了艾滋病的蔓延。然而,在发展中国家,HAART疗法并未得到广泛使用,HIV-1感染者迅速产生抗药性,以及社会对艾滋病防治的宣传不足等因素势必导致其继续蔓延。因此,寻找新的抗病毒靶点并建立相应的药物筛选平台显得尤为重要。 真核细胞在逆转录病毒的作用下逐渐产生内在的抗病毒因子。近期,宿主细胞因子载脂蛋白B tuRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(apolipoprotein BmRNA-editing enzyme-catalytic polypeptide-like 3G APOBEC3G)被证实可以阻止逆转录病毒的复制。HIV-1病毒感染因子(viral infectivity factor,Vif)和APOBEC3G之间相互作用的研究证实Vif将成为抗HIV药物开发的新靶点。 本研究包括理论研究和应用研究,主要是针对APOBEC3G与HIV-1 Vif基因的克隆、表达、相互作用机制等的理论研究,在理论研究的基础上,同时对靶点药物进行了研究。 首先,从H9细胞中提取总RNA,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术获得人APOBEC3G(hA3C)基因。应用PCR技术从HIV-1 NL4.3 cDNA质粒中扩增vif基因,vif基因全长为579核苷酸(nt),翻译成含192个氨基酸的蛋白质。将测序鉴定过的目的基因克隆到原核表达载体pET-32a上。采用Vector NTI AlignX软件将pET-vif测序结果与HIV-1 NL4.3 vif sequence(GenBank登录号：AF070521)进行比对,pET-APOBEC3G测序结果与hA3G基因原始序列(GenBank登录号:NM-021822)进行比对,比对结果显示已经成功地构建了pET-vif和pET-APOBEC3G重组质粒。 随后,将所构建的重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中以包涵体的形式高效表达,目的蛋白C端融合6×His标签便于纯化及鉴定。应用SDS-PAGE及Western Blot等方法确保原核表达目的蛋白的特异性。蛋白凝胶自动扫描分析表明,Vif蛋白表达量约占全菌体总蛋白的17.70％,hA3G蛋白表达量约为22.32％,Vif融合蛋白的纯度可达80％以上。另外,Vif蛋白可以与BIAcore芯片方便耦联,适宜于快速筛选能够与靶蛋白结合的物质。所以可以将其视作药物筛选的方法之一。在本研究中,应用BIAcore确定Vif与药物之间的相互作用,从29个检测药物样品中筛选出3个与芯片表面Vif蛋白的结合能力明显高于阴性对照的药物,构建了以Vif蛋白为靶点的抗HIV-1药物研究平台。针对Vif靶点的药物KA-06对HIV-1的IC50为0.15μg/mL。应用纯化后的目的蛋白免疫日本大耳白兔,以间接ELISA法测定兔多克隆抗体滴度。抗Vif多克隆抗体滴度可达1:204 800,抗hA3G多克隆抗体滴度为1:102 400。进一步证实原核表达纯化所得的目的蛋白具有良好的免疫原性和抗原性。通过BIAcore SPR技术测定制备的抗Vif的多克隆抗体稀释100倍后Vif蛋白的结合值为213 RU。应用免疫酶法和免疫荧光法检测证明多克隆抗体的特异性。 最后,我们又进一步研究了表达hA3G蛋白的非允许性细胞的抗病毒活性,以及HIV-1 Vif对病毒感染力的影响。为了证明非允许性细胞对病毒感染力的抑制作用,将HIV-1 WT和HIV-1 △Vif病毒质粒转染进293T细胞,48 h后检测所产生的病毒粒子逆转录酶活性,用具有相同逆转录酶活性的病毒分别感染H9细胞和MT4细胞。在感染后的4、8、12 d收获含病毒的上清,检测其逆转录酶活性。BHlO WT病毒株感染H9细胞产生的子代病毒的逆转录酶活性在感染后12 d后达到高峰,BH10 WT病毒株在MT4细胞中复制很快,在感染后4 d已经具有较高的逆转录酶活性。BH10 △Vif病毒株感染H9细胞产生的子代病毒的逆转录酶活性接近细胞对照水平,而其在MT4细胞中产生的子代病毒的逆转录酶活性在感染后12 d出现。但BH10 △Vif病毒株在MT4细胞中产生的子代病毒的逆转录酶活性与野生毒株相比活性降低。结果表明Vif蛋白除了通过拮抗非允许性细胞内的hA3G等抗病毒因子之外,还通过其他的机制影响病毒的复制。 应用分子克隆技术构建pEGFP-APOBEC3G质粒,表达带有绿色荧光蛋白标签的hA3G蛋白。BH10 WT或BH10 △Vif质粒分别与不同剂量的pEGFP-APOBEC3G质粒共转染293T细胞。荧光显微镜下可见带有绿色荧光蛋白标签的hA3G定位于细胞浆,而绿色荧光蛋白位于整个细胞,定位于细胞浆的hA3G可能抑制逆转录病毒复制中与长末端重复序列相关的逆转录过程。MAGI检测结果显示BH10 △Vif质粒与0.2μg pEGFP-APOBEC3G共转染产生的病毒粒子的感染力比仅转染BH10 △Vif质粒产生的病毒粒子的感染力低9倍,随着pEGFP-APOBEC3G转染剂量的增加△Vif病毒粒子的感染力亦随之显著降低,病毒滴度由2.75×104 U/mL降至3.38×102 U/mL。在不表达hA3G的情况下,BH10△Vif病毒的单轮感染力与BH10 WT并无明显差异,但hA3G的过表达会降低BH10 WT的感染力。RTase检测与MAGI检测结果一致,均能准确反映病毒粒子的感染力。本实验的研究使我们对hA3G的抗病毒活性和HIV-1 Vif在病毒复制过程中的作用机制有了新的更深入的认识,并将Vif作为治疗HIV-1药物开发的新靶点,成功的构建了药物筛选和评价系统,可以迅速准确的筛选出有效的抗HW-1药物。