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土壤中微量元素的缺乏会极大的限制大部分作物产量的提高、品质的改良,缺乏微量元素的食物也可能进一步影响到人体健康。土壤缺铁是农业生产中普遍存在的一种非生物胁迫,在覆盖地球表面30%以上的石灰性土壤中不同程度的缺铁,在这种逆境中生长的作物往往表现出典型的缺铁症——“失绿症”,由其所得产品的产量和品质均有下降,因此,铁是作物产量和品质的关键决定因素之一。高粱是世界第五大粮食作物,在我国主要用作酿酒、制醋、制糖,又是优质的饲料作物,不仅具有很高的食用、药用等营养价值,而且具有生物能源等潜在价值可供开发。由于高粱在我国北方、中原和新疆等地广泛种植,这部分碱性石灰性土壤普遍缺铁,对铁胁迫下的响应探究则成为研究作物耐低铁机理、提高其产量,改善其品质的关键。前期研究已经发现了SbbHLH1能够负调控木质素的合成过程,对水稻中SbbHLH1蛋白同源序列的研究,发现其可能参与了植物铁营养平衡。本文以高粱(Sorghum bicolor L.Moench)的SbbHLH1基因为研究对象,利用野生型和SbbHLH1过表达拟南芥株系为实验材料,对该基因参与植物铁营养平衡进行初步的探究。本实验室前期已经从高粱中克隆到了SbbHLH1基因,其蛋白产物SbbHLH1作为转录因子,定位在细胞核和细胞质(闫丽博士论文,2011)。通过生物信息学分析发现,SbbHLH1基因含有3个外显子和2个内含子,SbbHLH1蛋白含有244个氨基酸,其包含保守的bHLH结构域,该结构域具有结合DNA并进行二聚体化的功能。该基因属于bHLH家族转录调节因子,在拟南芥中的同源蛋白包括ORG蛋白,例如AtbHLH38及AtbHLH39等,这两个转录因子与FIT转录因子共同作用参与调控下游缺铁响应基因的表达。通过序列比对发现,SbbHLH1蛋白与AtbHLH38/39/100/101具有一定的同源性,而SbbHLH1基因的启动子分析发现该基因可能与茉莉酸(JA)响应相关,而茉莉酸正是已经验证的负调控缺铁相关基因表达的重要因子,通过以上生物学分析,发现SbbHLH1转录因子很可能参与植物对缺铁胁迫的响应。在缺铁及完全无铁的胁迫处理下,SbbHLH1过表达系表现明显的抗缺铁性,其根长、侧根数及地上部分相对于野生型(Col-0)所受到的抑制明显降低,证明了SbbHLH1基因参与了对缺铁胁迫的响应。为了研究SbbHLH1参与拟南芥缺铁响应的方式,本研究发现,在缺铁胁迫下,SbbHLH1过表达株系中的AtbHLH1 04与AtZIF1、AtYSL3、AtEIL1及AtEIN3等基因均显著上调,具有相似的表达;在完全无铁的胁迫条件下,SbbHLH1过表达株系中的AtbHLH38与AtbHLH101、AtAHA2及AtAOX1的表达水平也明显高于野生型,呈现相同的上调表达趋势。SbbHLH1可能主要通过Fit非依赖型途径调控铁的稳态。在H202产生的氧化胁迫下,SbbHLH1过表达系和野生型的生长均受到抑制,根长变短,侧根数增加,但过表达系拟南芥幼苗的生长较野生型表现更强的耐受性,受到的抑制更轻,过表达系的平均叶片数量、平均根长及侧根数目都显著高于野生型。尤其是侧根数及根长,随着外源添加的H202浓度的升高,过表达系比野生型的优势更加显著。为了进一步探究SbbHLH1对抗氧化胁迫的机制,本实验测定了拟南芥过表达系及对照在氧化胁迫处理前后H2O2的含量,研究发现在无胁迫处理的拟南芥幼苗中,过表达系的H202含量就显著低于野生型,在缺铁胁迫和外源添加了 H2O2后,虽然各系的H2O2含量都有所提高,但缺铁胁迫下各系的H2O2含量相较于H2O2处理下的相对增加值减少,随着氧化胁迫的加强,在过表达系中的H2O2含量比野生型减少的程度显著增加。通过RT-PCR研究发现,在缺铁胁迫和完全无铁的胁迫条件下,SbbHLH1过表达系中与ROS生成及清除相关maker基因的表达量较野生型相比均明显下调,例如ROS生成基因AtRbohC和AtRbohD及ROS降解酶基因FeSOD1、AtCu/ZnSOD1及AtCAT1和2。综合以上结果发现,SbbHLH1基因通过上调与铁的获取及运输过程相关基因的表达,从而对缺铁胁迫产生响应。SbbHLH1可能通过降低细胞内的H2O2含量提高了转基因拟南芥对氧化胁迫的抗性,SbbHLH1基因降低了缺铁胁迫下植物体内的ROS的累积。