论文部分内容阅读
流感的爆发严重威胁人类的健康和经济的发展,现代流感疫苗的生产更趋向基于无血清悬浮细胞的工艺。MDCK细胞系是公认为最适合甲、乙型流感病毒疫苗生产的三大细胞系之一,但该细胞固有贴壁依赖性,为了避免细胞悬浮驯化过程中由于传代数目过多,导致用于大规模疫苗生产的细胞活性和增值效率降低,结团率升高这一问题,利用基因工程手段,有针对性地改造细胞表面粘附分子,抑制细胞的粘附性状,构建MDCK悬浮细胞系,将更符合现代疫苗生产需求。目前有关MDCK细胞上发挥粘附功能的有效蛋白及其粘附机制的研究少有报道,所以找出MDCK细胞表面的主要粘附蛋白并对其编码基因的表达进行抑制或敲除是解决问题的关键。本研究通过iTRAQ(Isobaric tag for relative and absolute quantitation)定量蛋白质组学分析技术,将本实验室驯化获得的MDCK悬浮细胞与相同来源的MDCK贴壁细胞进行差异蛋白分析,筛选MDCK细胞上可能与粘附相关的蛋白,选择了其中经典的粘附分子E-钙粘蛋白(E-Cadherin,CDH1),E-钙粘蛋白的编码基因为CDH1基因,通过RNA干扰技术构建CDH1低表达的MDCK细胞株,检测该细胞的胞间粘附功能,探究CDH1在MDCK细胞间粘附过程中的作用,为基因工程手段建立MDCK悬浮细胞系筛选有效靶基因,研究结果发现:1.以MDCK贴壁细胞为对照,MDCK悬浮细胞中共有643个显著性差异蛋白,其中389个表达量上调,254个下调。差异蛋白功能聚类分析结果显示:很多差异蛋白参与到分子代谢等过程,分布于囊泡和外泌体上等,涉及到催化、粘附、生长代谢等方面。2.经过筛选得到MDCK细胞上可能与粘附相关的蛋白12个:钙粘蛋白类的E-钙粘蛋白(CDH1)、连环蛋白α1(CTNNA1)、连环蛋白β1(CTNNB1)、钙调节蛋白3(CNN3);桥粒的重要组成成分桥粒斑蛋白(DSP)、桥粒芯蛋白3(DSG3)、桥粒斑株蛋白(JUP);以及肌动蛋白α(ACTN1)、二肽基肽酶4(DPP4)、微囊蛋白1(CAV1)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)和转谷氨酰胺酶2(TGM2)五种粘附相关蛋白。3.利用RNA干扰技术,慢病毒感染的方法,构建了CDH1蛋白低表达的MDCK细胞株,表达水平降低达68%。通过CCK8法和细胞计数法检测细胞间粘附功能,观察细胞形态并通过细胞生长曲线分析细胞活力,TCID50法分析H1N1流感病毒在细胞内的复制水平。发现CDH1低表达显著抑制了MDCK细胞间的粘附,细胞形态发生了略微改变但并未显著影响细胞生长活力,同时CDH1低表达并未显著影响流感病毒在MDCK细胞内的复制水平。结论:CDH1参与MDCK细胞间的粘附过程,CDH1低表达不显著影响细胞活力和流感病毒复制水平,CDH1低表达可能有利于构建适合流感疫苗生产的MDCK悬浮细胞系。