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一氧化氮(nitric oxide，NO ) 是一种无机自由基气体，作为一种特殊的生物传递信号分子，日益受到生命科学各领域的普遍重视。机体内的NO是通过三种一氧化氮合酶（nitric oxide synthase, NOS）合成。NOS在体内的分布极为广泛，几乎遍布机体的每一个系统。研究表明，哺乳动物雌性生殖过程中的重要环节，诸如卵泡的发育和成熟、胚胎的植入、妊娠的维持、分娩等许多生理过程中，NO发挥重要的调节作用。为探讨NO在哺乳动物胚胎植入过程中的信号通路及分子机制，本研究应用小鼠胚胎植入的体外模型，将常规方法获取的胚泡随机培养在含有不同处理药物的培养液中，在培养12、24和36 h后分别观察、统计胚泡黏附、扩展的情况，同时收集培养液，用明胶酶谱法分析其中MMP-2蛋白的变化，半定量RT-PCR分析各组胚泡中MMP-2 mRNA的变化。研究结果表明，500μM NOS抑制剂L-单甲基-精氨酸（L-NMMA）可以显著抑制小鼠胚泡的黏附、扩展及MMP-2的分泌（P<0.05），此抑制可以被同时加入的100μM NO供体S-亚硝基-乙酰青霉胺（SNAP）逆转（P﹥0.05）。提示NO对小鼠胚泡体外黏附、扩展及MMP-2的分泌具有重要的影响。此外，在使用NOS抑制剂500μM L-NMMA时，同时加入20μM的cGMP类似物8-Br-cGMP，也可以逆转这种抑制效果，胚胎的黏附和扩展与对照组相比差异不显著(P＞0.05)。结果进一步提示，NO对小鼠胚胎黏附、扩展及MMP-2的分泌影响可能是通过其下游分子cGMP通路进行，而且对MMP-2的作用可能是在基因水平进行调节。为了进一步了解NO调节胚胎植入过程的分子机理，将eNOS基因转入作为研究植入的模式细胞JAR当中，建立可控的内源表达NO的模型。应用脂质体介导转染技术将人内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因转入JAR细胞，获得转染阳性细胞。用RT-PCR和Western blot技术从基因及蛋白水平对表达产物进行鉴定，结果显示，阳性细胞有较高水平的mRNA转录和特异目的蛋白表达并通过免疫细胞化学方法获得证实，与对照组相比，转染eNOS基因的阳性JAR细胞<WP=6>高表达外源eNOS蛋白；但是一氧化氮合酶（NOS）活性及其催化产物NO并没有直接升高；但使用适当浓度的钙离子激动剂A23187处理则能增加NOS的活性。这些结果说明，在转染的JAR细胞中，eNOS已得到表达，但没有被直接激活。实验过程中，使用0.5μM A23187对转染阳性组（EA）与转染阴性组（MA）进行诱导，并与转染阴性非诱导组（M）及对照组（C）进行比较,差异均不显著(P>0.05)；使用2μM A23187进行诱导，EA组与MA组、M组和C组比较,差异显著(P<0.05)，但MA与M组及C相比NO增加,但统计分析差异并不显著;用8μM A23187进行诱导，EA组与ME组与C组相比，差异极显著(P<0.001)；而MA组在该剂量的A23187作用下，与E组及C组相比，NO产生差异显著(P<0.05)。这样用8μΜA23187诱导的转染组，建立一个产生内源NO的细胞模型。应用该转染细胞模型分别产生高、低浓度NO，进行细胞增生、迁移及MMP-2分泌实验；同时用外源NO供体SNAP分别以低浓度50μM（S1）和高浓度500μM（S2）分别处理JAR细胞，进行上述增生、迁移和MMP-2分泌实验。结果显示，EA组与M组相比，对细胞的迁移、增生及MMP-2分泌具有显著的抑制作用（P﹤0.05）；相反MA组与M组相比细胞的迁移、增生及MMP-2分泌具有显著的促进作用(P<0.05);而M组与C组无明显差异(P>0.05)。同时用外源NO供体50μM的SNAP处理细胞与C组相比，对细胞迁移、增生及MMP-2分泌具有显著的促进作用(P<0.05)；500μM SNAP处理细胞与C组相比则对迁移、增生及MMP-2分泌具有抑制效应（P﹤0.05）。应用免疫印迹分析，Akt/PKB Ser-473磷酸化状态均发生相应的变化，提示NO可能通过Akt/PKB信号通路影响MMP-2分泌及细胞增生、迁移。本研究首次系统地说明，在JAR细胞中,无论是内源产生NO或是外源NO,由于NO的浓度差异，造成NO对细胞迁移、增生和MMP-2分泌具有不同的作用，NO在低浓度时起促进作用，高浓度时起抑制作用；而调节过程可能是通过激活Akt/PKB信号通路而使Akt/PKB Ser-473磷酸化起作用。整合素连接激酶(Integrin-linked kinase,ILK)是新近发现的一种分子，该分子对细胞的生理功能和病理过程具有重要作用。本研究用野生型(WT-ILK)、酶灭<WP=7>活型(KD-ILK)及其空载体(Mock) 三种表达质粒转染JAR细胞，进而研究ILK对NO的调控作用。结果表明, 与M组相比，转染WT-ILK组细胞产生NO的量显著增加（P<0.05）；而转染KD-ILK组细胞产生的NO与M组相比却显著降低(P<0.05)，而转染空载体M组与对照组相比，无显著差异（P﹥0.05）。各实验组中NOS变化与NO相似，这些结果说明ILK通过激活NOS促进NO的产生。用MTT法测定各组细胞增生情况，发现WT-ILK转染组明显高于对照组（P<0.05）；而转染KD-ILK则低于对照组，差异显著（P<0.05）。同时用明胶酶谱方法分析MMP-2的变化，转染WT-ILK质粒的细胞MMP-2分泌与对照组比较，MMP-2分泌显著增加（P<0.05），而转染KD-ILK的细胞MMP-2分泌量与对照组相比，显著降低（P<0.05）。然后用免疫印记迹的方法分析eNOS及Akt/PKB Ser-473磷酸化的变化,与NO变化保持平行。本研究说明，ILK可以通过eNOS来产生NO,而对eNOS的调节可能是通过Akt/PKB信号?