研究背景：　　肿瘤多药耐药(multi-drug resistance，MDR)在相当一部分接受化疗的肿瘤患者中都有发生，这一现象的出现严重影响化疗药物的疗效及肿瘤患者的预后。顺铂是治疗头颈肿瘤最有效的铂类药物之一，它通过与DNA交联来干扰细胞分裂、诱导凋亡，从而杀灭肿瘤细胞。在临床上常用顺铂联合其他化疗药物治疗肿瘤患者，但随之出现的多药耐药现象使得顺铂的疗效大大降低。鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是中国南部及东南亚地区最常见的恶性肿瘤之一，在很大一部分接受顺铂化疗的中晚期鼻咽癌患者中同样存在多药耐药现象。　　肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是存在于肿瘤组织中的一小部分具有干细胞性质的细胞群体，它具有自我更新的能力，是形成不同分化程度肿瘤细胞和肿瘤不断扩大的源泉。肿瘤干细胞往往处于细胞分裂的静止期，并且可以有效地将药物排出胞外。现有治疗肿瘤的方法主要是针对肿瘤组织内的大多数增殖迅速的分化细胞，而无法杀灭肿瘤干细胞。在停止治疗后，肿瘤干细胞的再度活跃将导致肿瘤的复发。　　化学治疗过程中出现的多药耐药现象是导致化疗失败的主要原因，如何解决这一问题是目前抗肿瘤研究的热点，其中寻找多药耐药逆转剂(resistance reversal agents，RRA)是解决MDR问题的有效手段之一。流行病学研究结果显示，绿茶对多种肿瘤均有防癌抗癌作用，其有效成分表没食子素没食子酸酯(epigallocatechin gallate，EGCG)能通过多种途径抑制肿瘤的形成、生长和转移，并对肝癌MDR细胞具有一定的逆转作用。　　本课题是以鼻咽癌细胞为研究对象，通过体外诱导建立了人鼻咽癌耐药细胞系，并探讨其耐药机制;然后进一步利用EGCG联合化疗药物作用于耐药细胞系，如能有效逆转鼻咽癌细胞耐药，则可为解决临床上鼻咽癌患者多药耐药问题提供了一个可能的新途径。　　研究方法：　　1、顺铂敏感细胞株的筛选:通过MTT实验筛选对化疗药物顺铂较敏感的人鼻咽癌细胞株做为本课题实验研究对象。　　2、耐药细胞系的建立及耐药特征分析:采用大剂量冲击和逐步增加药物剂量相结合的方法诱导建立人鼻咽癌耐药细胞系;MTT法分别检测药物对亲代细胞及耐药细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration，IC50)，并计算耐药指数(resistance index，RI);倒置显微镜下对比观察亲代细胞及耐药细胞的形态学差异;通过流式细胞术(fluorescence activated cell sorting，FACS)分别检测亲代细胞和耐药细胞的细胞周期。　　3、交叉耐药:通过MTT实验分别检测长春新碱、氟尿嘧啶、紫杉醇、氨甲蝶呤、多柔比星及阿糖胞苷等细胞毒药物对亲代细胞及耐药细胞的敏感性，分析所建立的鼻咽癌耐药细胞系的多药耐药性。　　4、相关蛋白表达水平的检测:通过Western blot实验检测亲代细胞和耐药细胞中耐药相关蛋白及上皮-间充质转变(Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT)相关蛋白的表达水平。　　5、耐药相关基因的mRNA表达水平的检测:实时荧光定量PCR(real time quantitative PCR，QPCR)实验检测亲代细胞和耐药细胞之间的耐药相关基因的表达水平。　　6、鼻咽癌耐药细胞的肿瘤干细胞特性分析:通过流式细胞术分别检测亲代细胞和耐药细胞中侧群(side population，SP)细胞的比例，Aldefluor法检测ALDHl+细胞的多少和无血清悬浮培养法检测两组细胞肿瘤球形成率的高低。　　7、EGCG逆转耐药效率的检测:通过MTT法检测逆转剂EGCG逆转鼻咽癌细胞耐药的效率，并计算其逆转倍数(reversal factor,RI)。　　8、逆转耐药机制的分析:通过对比检测单一用药及联合逆转剂用药后耐药细胞中细胞凋亡比例的改变，检测SP细胞及ALDHl+细胞比例变化。　　9、相关蛋白的表达水平检测:Western blot法检测单一用药和联合逆转剂后耐药细胞中肿瘤干细胞标志蛋白及多药耐药相关蛋白的水平变化。　　研究结果：　　1、6株人鼻咽癌细胞株对化疗药物顺铂的敏感性各不相同，其中CNE2细胞株对顺铂较为敏感，其半数抑制浓度为（0.62±0.04）μmol/L，能在含有低浓度顺铂的培养基中缓慢生长，因此选择CNE2细胞株做为本实验的研究对象。　　2、建立了人鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/CR，顺铂对耐药细胞系的半数抑制浓度最终为（25.2±0.60）μmol/L，其耐药指数(resistance index，RI)为40;在形态学方面，与亲代细胞对比，耐药细胞胞体相对较小，呈均一的梭形，并伸出伪足，贴壁能力减弱，传代时胰酶消化时间缩短;Western blot实验检测EMT相关蛋白，结果显示与亲代细胞对比，耐药细胞中E-cadherin、cytokeratin降低，N-cadherin、vimentin升高，提示耐药细胞发生上皮-间充质转变。细胞周期检测提示耐药细胞较亲代细胞G1期细胞比例升高，S期、G2期细胞比例降低，耐药细胞较亲代细胞的增殖指数(proliferation index，PI)降低;CNE2/CR对细胞毒药物紫杉醇、氟尿嘧啶、长春新碱、氨甲蝶呤及阿霉素存在不同程度的耐药，而对阿糖胞苷的敏感性略有增加。　　3、QPCR检查耐药相关基因mRNA水平，结果表明与亲代细胞对比，耐药细胞系中MDR1/P-gp明显升高，ABCC2略有升高，ABCC1、ABCG2降低。Western blot实验进一步验证耐药细胞系中耐药相关蛋白MDR1/P-gp升高、ABCG2降低。　　4、FACS检测结果显示耐药细胞较亲代细胞的SP细胞比例明显升高，二者比例分别是13.9％和1.2％，差异具有统计学意义;耐药细胞中ALDH1+细胞比例亦明显增高;肿瘤球形成实验结果表明，与亲代细胞对比，耐药细胞的肿瘤球形成率较高，所形成的肿瘤球体积更大;Western blot实验结果显示耐药细胞中肿瘤干细胞相关蛋白β-catenin、c-Myc表达水平升高。　　5、单药EGCG对亲代细胞和耐药细胞的半数抑制浓度分别为156.95μmol/L和105.70μmol/L;对比检测单一顺铂用药及联合EGCG用药对CNE2/CR的抑制效率，结果表明顺铂对CNE2/CR的IC50由31.05μmol/L降至1.41μmol/L。　　6、用AnnexinV-FITC试剂盒检测EGCG对细胞凋亡的作用。单药EGCG浓度分别设置0、60、180μmol/L。分别作用于CNE2和CNE2/CR细胞，两组细细胞凋亡比例分别为3.4％、5.7％、14.0％及8.2％、14.5％、51.3％;进一步对比检测单一用药及联合EGCG用药对细胞凋亡比例的影响，结果显示联合用药后耐药细胞凋亡比例明显增加，凋亡率分别为5.9％（ctrl组）、16.2％（EGCG组）、74.7％(EGCG&DDP组)。　　7、单药EGCG浓度分别设置0、60、180μmol/L作用于耐药细胞，流式细胞术检测SP细胞比例分别为17.2％、0.4％、0％;单药EGCG浓度分别设置为0、5、10、20、30μmol/L作用于耐药细胞的肿瘤球，肿瘤球的形成率依次降低，所成肿瘤球体积依次变小;流式细胞术检测结果显示EGCG作用组中ALDHl+细胞比例明显下降;进一步对比单一EGCG用药和联合用药后耐药细胞中SP细胞的比例依次为12.3％（ctrl组）、5.3％（EGCG组）、1.8％（EGCG&DDP组）;Western blot实验结果显示与单一用药组对比，联合用药后CNE2/CR细胞中肿瘤干细胞相关蛋白β-catenin、c-Myc明显降低。　　8、Western blot实验结果显示，与空白组对比，单一EGCG用药组及联合用药组中耐药相关蛋白MDR1/P-gp均降低，且后者降低更明显。　　研究结论：　　1、成功建立了人鼻咽癌顺铂耐药细胞系CNE2/CR，细胞体外培养和细胞周期检测发现，与CNE2相比，CNE2/CR的生长速度减慢，增殖活性较弱，其处于G0/G1期的细胞比例显著升高，S期的比例显著下降，而G2期的改变不明显。　　2、CNE2/CR对细胞毒药物紫杉醇、氟尿嘧啶、长春新碱、氨甲蝶呤及阿霉素存在交叉耐药，而对阿糖胞苷的敏感性略有增加;QPCR证明CNE2/CR细胞系中耐药相关基因MDR1/P-gp的mRNA较亲代细胞升高;Western blot实验进一步证实多药耐药相关蛋白MDR1/P-gp显著升高。因此，CNE2/CR耐药细胞系存在多药耐药性，耐药机制与MDR1/P-gp耐药相关蛋白表达增加有关。　　3、耐药细胞CNE2/CR形态学的改变及Western blot实验结果显示耐药细胞中Ecadherin、Cytokeratin降低，Ncadherin、Vimentin升高;这些结果表明CNE2/CR发生上皮细胞向间质细胞转变，这可能也是CNE2/CR产生耐药的机制之一。　　4、流式细胞术对比检测亲代细胞及耐药细胞中SP细胞及ALDH1+细胞的比例，结果显示耐药细胞中SP细胞及ALDH1+细胞比例明显增加;进一步肿瘤球培养实验显示耐药细胞的肿瘤球形成率更高，所形成的肿瘤球体积更大，这些实验证明CNE2/CR耐药细胞的形成是一个富集肿瘤干细胞的过程。　　5、随着EGCG药物浓度的升高，耐药细胞凋亡比例增加，而肿瘤球的形成率下降，肿瘤球体积变小;通过这些实验结果表明EGCG对耐药细胞抑制作用具有剂量依赖性。　　6、通过MTT实验检测顺铂单一用药和联合EGCG后两组半数抑制浓度IC50分别为31.05μmol/L、1.41μmol/L,该实验证明EGCG能有效逆转CNE2/CR耐药，其逆转指数RI为22。　　7、联合EGCG逆转剂作用后耐药细胞的凋亡率明显增加，该实验证明EGCG有效逆转CNE2/CR的耐药机制可能是通过促进耐药细胞凋亡实现的。　　8、联合EGCG逆转剂作用后，耐药细胞中SP细胞的比例明显降低，进一步的Western blot实验证实肿瘤干细胞相关蛋白β-catenin、c-Myc均明显降低，该实验证明EGCG逆转人鼻咽癌细胞耐药的机制可能是通过有效杀灭肿瘤干细胞实现的。　　9、联合EGCG逆转剂作用后多药耐药相关蛋白MDR1/P-gp表达水平明显降低，该实验证明EGCG逆转CNE2/CR耐药可能是通过抑制MDR1/P-gp表达，升高细胞内有效药物浓度，达到杀灭耐药细胞的目的。