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椎间盘退行性疾病在临床上极为常见,是引起颈肩腰腿痛的常见原因。椎间盘内髓核细胞衰老或功能失调导致的髓核退变是椎间盘退变的重要始动因素。干细胞移植可以直接针对病因对退变髓核进行再生修复,而脂肪来源的间充质干细胞(adipose-derived stem cell,ADSC)由于其获取容易,且具备向髓核细胞分化的潜能,常被作为退变髓核生物学修复的种子细胞。然而干细胞在退变椎间盘恶劣的微环境中分化困难,严重制约了髓核退变的干细胞治疗。生物支架充当干细胞的移植载体,同时也能为载荷干细胞生长提供特殊微环境,已成为基于干细胞的组织工程治疗髓核退变的关键要素之一。然而现有的生物支架存在各种缺陷,因此迫切需要更为完善且适用于椎间盘的新型生物支架。髓核相关细胞外基质Ⅱ型胶原(type Ⅱ collagen,CII)和硫酸软骨素(chondroitin sulfate,CS)是正常髓核的重要组分,且自身具有生物活性,对干细胞生存、分化等具有重要调节作用,是构建应用于髓核的生物支架的优良选择。本研究旨在利用髓核相关细胞外基质CII和CS构建预混ADSC的可注射凝胶样细胞递送系统,并在体外验证该系统诱导载荷ADSC成髄核细胞分化的效应。同时,通过对整合素受体,相关转录因子和信号通路的研究明确该系统调控ADSC成髓核细胞分化的具体机制。最后利用大鼠退变椎间盘动物模型在体验证该细胞递送系统修复退变髓核的效果。本研究共分为以下三个部分:(1)基于髓核相关细胞外基质的可注射凝胶样细胞递送系统的构建;(2)Ⅱ型胶原诱导ADSC成髓核细胞分化的机制研究;(3)可注射凝胶样细胞递送系统在体修复退变椎间盘的研究。第一章 基于髓核相关细胞外基质的可注射凝胶样细胞递送系统的构建目的:验证髓核相关细胞外基质CII与CS对ADSCs的生物活性,并以此构建可注射凝胶样细胞递送系统。方法:在低pH环境中分别利用不同浓度CII与CS构建凝胶培养ADSCs,细胞三维微球培养作为对照,培养3,7,和14天。通过CCK-8法测定细胞增殖,LDH法测定生物材料对细胞毒性,RT-qPCR检测炎症相关基因表达,Western blot分析检测成髓核相关蛋白表达。筛选适当浓度的CII和CS联合,构建可注射凝胶样细胞递送系统,并利用扫描电子显微镜,流变分析,茚三酮法等技术对递送系统相关表征进行测定,最后通过RT-qPCR,Western blot分析等检测递送系统中载荷的ADSCs成髓核细胞定向分化效率。结果:CII与CS均对ADSCs无明显毒性作用,CII浓度在3 mg/mL时即可显著提高其中ADSCs髓核相关标志性蛋白的表达,5-10 mg/ml CS可显著抑制ADSCs炎症相关基因表达。我们利用3 mg/ml CII和8.1 mg/ml CS,在0.02%(w/v)genipin的交联下,构建出预混ADSCs的可注射凝胶样细胞递送系统,该系统具有良好的成胶特性,稳定性,以及生物力学性能,并保持了 CII和CS的生物活性,在体外可明显提高Acan,Sox9,Col2a1,Krt19,及Pax1等髓核相关标记物的表达。结论:髓核相关细胞外基质CII与CS构建的可注射凝胶样细胞递送系统具有良好的理化特性,并可在体外诱导ADSCs成髓核细胞定向分化。第二章 Ⅱ型胶原诱导ADSC成髓核细胞分化的机制研究目的:探索髓核相关细胞外基质CII通过细胞表面整合素受体诱导ADSCs成髓核细胞分化的相关机制,明确整合素受体,转录因子FoxA2以及Shh信号通路间的相互作用。方法:通过慢病毒载体过表达和敲降ADSCs中FoxA2的表达,并培养于CII环境中。利用免疫荧光,RT-qPCR,和Western blot技术检测ADSC中整合素受体,髓核细胞相关标记物,以及Shh信号通路关键元件Shh和Glil的表达。通过阿利新兰染色,DMMB法和羟脯氨酸试剂盒检测ADSCs中糖胺聚糖和胶原的合成。并通过抑制剂和中和抗体验证整合素受体α2,转录因子FoxA2以及Shh信号通路间的相互作用。结果:CII诱导ADSCs成髓核细胞分化与FoxA2介导的Shh信号通路激活相关。过表达FoxA2显著提升髓核特异性基因的表达与细胞外基质的合成,敲降FoxA2后ADSC成髓核细胞分化效率降低,Shh信号通路激活受抑制。Shh信号通路抑制剂GDC-0449可部分逆转过表达FoxA2所引起的成髓核分化。此外,Ⅱ型胶原诱导的ADSCs成髓核分化与FoxA2抑制整合素受体α2表达相关,而整合素受体α2的抑制又可进一步促进ADSCs成髓核细胞分化。结论:CII通过上调FoxA2的表达激活Shh信号通路从而促进ADSC成髓核细胞定向分化,抑制整合素受体α2有利于FoxA2表达与Shh信号通路激活。第三章 可注射凝胶样细胞递送系统在体修复退变椎间盘的研究目的:明确预混ADSCs的可注射凝胶样细胞递送系统在体修复大鼠退变椎间盘的效果。方法:通过椎间盘针刺法构建SD大鼠尾椎间盘退变模型,造模成功2周后对相应组别进行材料注射:正常对照组:不作任何处理;退变对照组:造模后注射DMEM培养基;CCS组:造模后仅注射CII/CS水凝胶;ADSCs组:造模后仅注射ADSCs;CCSA组:造模后注射预混ADSC的可注射凝胶样细胞递送系统。在注射后0,4,8,和16周分别取材,通过钼靶摄影评估椎间盘高度,MRI评估椎间盘含水量,组织学染色和免疫组化评估椎间盘形态,髓核生化检测评估细胞外基质含量,并利用组织学评分量化椎间盘退变修复情况。结果:注射16周后CCSA组的椎间盘高度,髓核含水量,髓核细胞外基质含量等较退变对照组明显改善,椎间盘形态规则。CCSA组较ADSCs组和CCS组修复效果更为明显,仅次于正常对照组。结论:预混ADSC的可注射凝胶样细胞递送系统可在一定程度上修复SD大鼠退变椎间盘。