J亚群禽白血病的血清学调查和安徽分离株AH09/2特性研究

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禽白血病(Avian Leukosis,AL)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属禽反转录病毒引起的一种禽类多种肿瘤性疾病的统称。此病在世界各国鸡群中广泛流行,引起鸡死亡和消瘦、生长发育不良,同时引起机体抵抗力下降和免疫抑制,是危害养禽业的主要疾病之一。国外一些养殖业较发达的国家通过淘汰患病鸡群,减少垂直传播从而达到净化种群的目的。本研究使用IDEXX ALV抗原及抗体检测试剂盒对安徽地区鸡场祖代鸡和农贸市场商品鸡采集的样本进行检测,同时结合临床送检病例对安徽省禽白血病的感染情况进行调查。结果发现存在禽白血病的感染情况,在368份血清样品中,147份血清样品为ALV-J抗体阳性,仅有34份血清样品检测为ALV-A、B抗体阳性,26份样品同时检测出3种抗体阳性,说明ALV存在着A、B、J三种亚群的混合感染。经ELISA、IFA、PCR检测及测序鉴定,从阳性泄殖腔样品和送检病例中分离出6株病毒,依次命名为AH09/2和AH002~AH006。使用PCR方法对ALV-J分离株gp85基因进行扩增和测序,序列分析表明,AH09/2株与USA 2001和ALV-J原型株HPRS-103同源性最高,分别达到96.5%和97%,AH002~AH006与HPRS-103株的同源性均在95%以上;同国内其他地区的分离株相比同源性为87.5%~96.1%,而与A、B、C、D亚群的同源性仅为9.2%~11.9%。Gp85基因是ALV-J变异程度最大的基因,尤其是野毒株gp85基因变异程度更大,序列分析的结果显示分离株与国外毒株具有很高的同源性,表明该病毒株很大可能是通过祖代种鸡垂直传播而来而,野毒感染的可能性较小。将AH09/2株gp85基因序列克隆至pGEX-6p-1原核表达载体,进行GST-gp85融合导蛋白的表达,经SDS-PAGE电泳后可观察到大小为61KD的目的蛋白。通过Western-blot证明表达产物能与ALV-J阳性血清及ALV-J env基因单抗发生特异性反应。融合蛋白经纯化后,建立了ALV-J抗体ELISA间接检测方法,应用该方法对临床血清样品进行检测,结果表明,已建立的间接ELISA方法与进口IDEXX试剂盒检测结果阳性和阴性符合率分别可以达到85%和70.97%。   将分离株AH09/2经皮下注射和滴鼻2种途径接种于3日龄以内雏鸡(NDV HI<22),然后于7日龄进行新城疫IV苗免疫,免疫一周后(ALV-J感染组NDV HI<22,对照组24<NDV HI<25)用新城疫强毒HN3株对实验组样本攻毒。试验结果显示,ALV-J感染组的新城疫抗体水平明显低于正常对照组,并在新城疫病毒攻毒以后出现呼吸道症状、神经症状和提前死亡。同时其体内IL-2、IL-6和IFN-γ水平也低于同时期的对照组,而且也没有产生ALV-J的特异性抗体。表明该毒株对疫苗免疫具有明显的抑制作用可造成疫苗免疫失败。细胞因子水平低下可间接说明病毒已经影响到免疫细胞的成熟和正常分泌细胞因子的功能,造成机体免疫抑制,对外界病原的易感性增强而免疫应答能力下降。
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