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由玉米狄克氏菌Dickeyazeae(异名:Erwinia chrysanthemi pv.zeae)引起的水稻细菌性基腐病是水稻上重要细菌病害之一,在东南亚一些国家的水稻产区均有发生,我国大部分省份均有分布,局部地区发生严重,导致水稻大幅度减产,并造成巨大的经济损失。目前对该病原细菌的致病机理仍不十分清楚,尤其是双组分调控系统。因此,研究D.zeae的双组分信号转导系统对于进一步弄清其致病机理、寻找药物防治靶标和建立新型防病策略具有重要的意义。 本论文以D.zeae菌株EC1为研究材料,通过生物信息学分析和无痕敲除的方法,构建双组分调控系统ExpS/ExpA中传感蛋白ExpS的四个结构域突变体,分别为△HiskA、△HATPase、△REC和△HPT;克隆expS基因,进行功能互补获得其相应的互补体R-△HisKA、R-△HATPase、R-△REC和R-△HPT。进一步通过氨基酸定点突变的方法,构建并获得了ExpS信号传导途径中磷酸化位点的3个关键氨基酸残基的点突变体H299AA、D722AA和H826AA。生物学及表型测定的结果表明,△HiskA、△HATPase、△REC、△HPT、H299AA、D722AA和H826AA等突变体产生毒素的能力均明显下降,纤维素酶和果胶酸盐裂解酶活性减弱,并失去了抑制水稻种子萌发的能力;突变体△HiskA、△HATPase、△REC和△HPT接种水稻后,其致病力明显降低;而互补体R-△HisKA、R-△HATPase、R-△REC和R-△HPT的毒素产生能力、纤维素酶和果胶酸盐裂解酶活性以及对水稻的致病力等都与野生菌株相似。 为进一步明确双组分系统ExpS/ExpA所调控的下游致病基因,我们选择了D.zeae的全局调控基因rsmB、rsmA和kdgR、群体感应信号分子合成基因ExpI、Ⅲ型分泌系统基因hrpN、毒素合成基因ZmsA、果胶酸盐裂解酶基因PelA、PelB、PelC、PelD、PelE、纤维素酶基因CelZ、CelY、蛋白酶基因PrtG、PrtB以及多聚半乳糖醛酸酶基因PglR等16个基因,通过RT-PCR方法对它们在ExpS和ExpA基因突变体(△expS和EP87)中的转录表达进行分析,结果表明,ExpS/ExpA直接或间接正向调控rsmA基因、毒素合成基因ZmsA、果胶酸盐裂解酶基因PelA-E、纤维素酶基因CelZ和CelY、蛋白酶基因PrtB和PrtG、多聚半乳糖醛酸酶基因PglR的表达;而对kdgR、ExpI、hrpN等基因的表达没有影响;ExpA正向调控rsmB基因表达,而与ExpS无关。 本论文结果为进一步了解水稻基腐病菌的致病因子和从分子水平上进一步明确D.zeae的致病机理及其信号调控机制,完善植物病原细菌的致病性综合调控网络奠定了基础,也为其它病原细菌双组分调控系统的研究提供了有价值的信息。