肝脏具有代谢、解毒、合成等功能,是体内不可缺少的重要器官。对于末期肝纤维化、肝癌及各种急慢性肝衰竭患者,肝移植仍是至今为止最有效的治疗方法,然而,供体缺乏、手术复杂、费用较高等缺点使其难以广泛开展,因此生物人工肝等各种体外支持系统、细胞移植这些方法逐步成为治疗上述末期肝脏疾病的重要手段,以暂时取代肝脏功能,为肝移植创造条件。生物材料作为生物人工肝的重要组成部分,它能为细胞提供类似胞外基质的微环境,使肝细胞等贴壁细胞能够有效维持其表型及功能,另外,通过调节材料的相关理化性质,能有效促进细胞增殖、分化并提高其功能,生物材料还能够保护细胞免受缺氧与炎症细胞等的损伤,使其成为理想的保护屏障,并用于细胞移植及培养。水凝胶材料是生物材料的一种,它是以水为分散介质,由亲水性分子或共聚体交联形成,具有三维网状结构,不溶于水的聚合物。水凝胶材料因具高含水量、良好生物相容性等突出优点,至1960年来,逐渐被研究用于生物人工肝及肝组织工程中,同时材料相关理化特性,种类及设计方案选择也成为该领域研究热点。水凝胶材料在大体上可分成两种：一种为天然水凝胶材料,此类材料由天然细胞外基质提取获得,具良好生物活性,但提纯费用高、力学性质不可控、重复性差等使其在使用上受到局限；另一种为合成水凝胶材料,该类材料在重复性及可调控性上具优势,但生物活性并不高。其次,应用中各种化学交联剂、物理交联方法等对细胞都有不同程度的损伤。因此近年研究旨于通过温和交联方法将上述两种材料联合应用,以获得具有生物活性及重复性良好的可调节水凝胶材料。PEG为合成水凝胶材料,它易于操控、改性、修饰,且稳定性好；而肝素是肝内富含的多聚糖,结构中具特殊结合域,能与各种蛋白、生长因子结合并使其缓慢释放。因此,本研究通过将肝素改性,后经麦克尔加成这一温和化学反应方法与支链丙烯酸化聚乙二醇(PEG)交联形成一种混合型水凝胶,并对其进行检测,最后辅以微加工模具方法制成水凝胶微粒。为肝脏重构及相关药物分析提供一种较为理想的材料。目的：1.利用酰胺化反应(碳二亚胺法),通过控制反应物比例对肝素进行改性,获得各种转化率的硫醇化肝素,为后续PEG-肝素水凝胶合成奠定物质基础。2.经麦克尔加成反应,通过调整肝素转化率、前成胶液浓度等获得不同力学性质的水凝胶,并通过微加工模具制成水凝胶微粒,为肝脏组织工程提供一种较为理想的材料。方法：1.肝素改性：合成硫醇化肝素。(1)硫醇化肝素的制备：将分子量恒定的肝素(根据其结构上羧基的数量)通过碳二业胺法,分别加入不同比例的EDC、HOBT及半胱胺混合,充分反应后透析,然后加入DTT,断裂二硫键,再次透析,冻干。最终将半胱胺连接于肝素结构中的羧基上,获得转化率不同的硫醇化肝素。(2)硫醇化肝素(Hep-SH)的测定：定性测定：通过核磁共振氢谱检测半胱胺上两个甲基峰,与未改性肝素进行比较,证明硫醇化肝素成功合成。定量测定：取一定量硫醇化肝素,通过紫外分光光度法,以L-半胱氨酸作为标准品,利用Ellman试剂测量其溶液在412nm处吸光度,然后计算出肝素转化率。2.PEG-肝素水凝胶微粒制备及功能测试；(1)PEG-肝素水凝胶合成：将转化率为30%、40%、50%的Hep-SH及丙烯酸化PEG按照巯基与丙烯酸基团1：1的比例混合,然后加入PBS充分混匀制得浓度分别为5wt%、10wt%、15wt%的前成胶液,置于37℃条件下,一段时间后,观察其形态及硬度上的变化。(2)PEG-肝素水凝胶力学性质测定：将转化率为30%、40%、50%的Hep-SH及5wt%、10wt%、15wt%三种前驱液浓度两两组合分成9组,分别溶解于PBS中混匀,置于流变仪中,检测条件为：间距=500μm、角速度=1 rad/s、拉力γ=0.1%、温度为37-C,以测定水凝胶模量随时间的变化。(3)水凝胶溶胀率测定：将上述分组交联后水凝胶浸泡于PBS中2天,直至质量不再变化,称量记录质量(Ws),随后将胶体冷冻干燥,完全脱去水分,称量质量(Wd),胶体溶胀率(Swelling ratios)=Ws/Wd,实验重复3次； (4)PEG-肝素水凝胶形态及表征观察：利用扫描电镜观察制备好的PEG-肝素水凝胶,观测其表面状态。(5)聚二甲基硅氧烷(PDMS)微型模具的制作：先以SU-8制成所需形状模具,用普朗尼克酸处理模具后,将PDMS预聚体与固化剂按照质量比为10：1充分混合,覆于其表面,充分除去气泡后于70℃烤箱中过夜,成型后小心取下PDMS微模具,于电镜下观察其孔径大小及均一性。 (6)制作PEG-肝素水凝胶微粒：将混匀后的水凝胶前成胶液置于PDMS为模具上,排出孔内气泡并充分填满微孔后置于37℃、5%C02孵箱中孵育10-20分钟,交联成型后取出,在光镜及扫描电镜下进行观察。结果：1.肝素改性：合成硫醇化肝素。通过碳二亚胺反应,控制反应中加入EDC、HOBT和半胱胺的比例,再用DTT断裂反应中形成的二硫键,成功将半胱胺分子连接至肝素结构中,制备出转化率不同的硫醇化肝素。利用紫外分光光度法和核磁共振氢谱检测对产物进行定量及定性检测,鉴定结果表明肝素改性成功：核磁共振氢谱检测提示：相对于空白对照(未改性肝素),在2.6ppm及2.8ppm附近,经改性肝素出现明显吸收峰,与半胱胺结构上两个碳原子吸收峰位置相同,同时随着比例增加,转化率升高,吸收峰峰值增大；紫外分光光度法提示：随着EDC、HOBT和半胱胺加入比例升高,硫醇化肝素在412nm处吸光度增强,通过计算得出,肝素结构中羧基转化率为30%--50%,各组间转化率有显著性差异(P<0.05)；以上检查结果都说明肝素改性成功,在结构上引入巯基,并且随着反应物投入比例增加,肝素上羧基转化率增加。2.PEG-肝素水凝胶及水凝胶微粒制备及功能测试；将不同转化率的硫醇化肝素及支链丙烯酸化PEG按巯基：丙烯酸基=1：1比例混合溶于PBS,制成浓度不同的水凝胶前成胶液。在37℃条件下除30%-5wt%组(肝素转化率为30%,前成胶液浓度为5%)在1小时内不能交联外,其余实验组在5-30分钟内都可成功交联形成水凝胶。流变学结果提示,30%-5wt%组在测量过程中弹性模量无明显变化,未成功交联,其余实验组随着转化率及浓度升高,胶体弹性模量(G’)可从-3.5×102Pa至-2.2-104Pa,并且交联时间亦有所减少。溶胀率测定提示,随着转化率和浓度提高,水凝胶溶胀率不断降低,由18.38+0.23至8.88±0.26,胶体含水量降低,析因分析转化率、浓度对溶胀率的影响,结果证明不同转化率之间有显著性差异(P<0.05),不同浓度之间有显著性差异(P<0.05),而浓度及转化率之间并无明显交互作用(P>0.05)。在综合其弹性模量、交联时间及溶胀率等因素参考,认为30%-10wt%及50%-5wt%两组更具可实施性及接近肝脏情况,前者交联时间成胶时间约10min、弹性模量G’约1.6×104Pa,后者约20min、G’约1.5×103Pa,并且两者溶胀率都在较高水平。随后通过将上述水凝胶前成胶液置于PDMS微加工模具中,成功制成PEG-肝素水凝胶微粒(上底1001μm,高及下底为300μm类台柱形),在光镜和扫描电镜下观察发现水凝胶微粒形状统一,表面光滑,脱水后的水凝胶则呈挛缩状。结论：通过碳二亚胺法,成功将半胱胺分子连接于肝素分子结构中,使肝素中含有巯基,通过调整EDC、HOBT及半胱胺比例,可获得不同转化率的硫醇化肝素。将硫醇化肝素按巯基：丙烯酸基=1：1的比例混合溶于PBS中,在37-C条件下,除30%-5wt%组外,其余各实验组都能在30min内交联形成胶体。并且随转化率及前成胶液浓度提高,获得水凝胶弹性模量上升,交联时间缩短。溶胀率测定提示,随着浓度及转化率的提高,溶胀率降低,提示水凝胶含水量降低。综合时间、弹性模量、溶胀率等参数,我们认为30%-10%wt及50%-5%wt两组更具可实施性及接近肝脏情况,前者交联时间制成t约10min、G’约1.6×104Pa,后者t约20min、G’约1.5×103Pa。最后,利用PDMS制成微加工模具,成功并将PEG-肝素水凝胶制成约300μm大小的微粒。本研究中,我们成功制备PEG-肝素水凝胶,它具有天然材料及合成材料各自的优点,合成方法温和,通过转化率及浓度的控制,可获得不同力学性质的水凝胶。通过微加工模具方法,能有效控制水凝胶形状,制成不同大小的微粒。因此该材料有望用于生物人工肝、肝细胞培养、药物测试等复杂器官组织工程中。