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Dirigent(Dir)基因广泛分布于陆生植物中,现在已经在很多物种中发现了dir序列。通过同源基因序列比对,可以将dir蛋白分为dir-a和dir-like亚家族(dir-b/d,dir-c,dir-e,dir-f,dir-g)。Dir蛋白可能参与植物中木质素和木脂素的合成,同时可能与植物的胁迫响应有关。
本实验室从小麦中得到三个dircDNA序列,分别属于dir-a,dir-b/d,dir-c亚家族,命名为dir13,dir4,Ta-JA11。为分析dir三个亚家族基因的不同功能,我们分别构建了dir13的正反义pKYLX71植物表达载体和dir4、Ta-JA1的dir结构域的正义pKYLX71植物表达载体,通过农杆菌介导的叶盘转化法转化烟草,成功获得了烟草转基因植株。Wiesner和Maule染色显示各个转基因株系木质素含量和组成成分与对照相比区别都不明显。RT-PCR分析各转基因烟草木质素生物合成酶基因的表达量变化情况,肉桂醇脱氢酶(CAD),肉桂酰辅酶A还原酶(CCR),咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)基因的表达量区别不明显。总木脂素含量检测结果显示,转dir13基因株系中含量明显上升,其它株系变化不显著。RT-PCR分析烟草松脂醇下游反应酶基因的表达量变化情况,结果显示转dir13基因烟草中松脂醇/落叶松树脂醇还原酶(PLR)基因表达量上调。对T0代转基因种子和T1代转基因叶片进行了抗性实验,包括盐、干旱(非生物胁迫)和接种烟草黑胫病菌、青枯病菌(生物胁迫)处理,结果显示转dir13和dir4的烟草对盐和干旱胁迫表现出一定抗性。烟草叶片接种病原体后,转dir13的烟草抗青枯病的能力得到提高,并且能在一定程度上抑制黑胫病的侵染。对转基因烟草的总木脂素提取物进行杀菌和抑菌实验,结果显示转dir13的烟草总木脂素提取物对青枯病有明显的杀菌和抑菌效果。对小麦接种叶锈病,发现dir13基因表达量上调,其它两个基因变化不明显。
本研究初步分析了小麦中dir基因各亚家族的功能。Dir可能不影响木质素的合成过程;dir-a亚家族可能参与木脂素的合成,并提高植物抵抗生物胁迫和非生物胁迫的能力;dir-b/d亚家族只能提高抗盐和抗旱能力;dir-c的dir部分并不能提高胁迫响应能力。