体色对于鱼类的伪装、配偶等生存与繁衍具有重要作用,也是人工选择的重要性状之一。鱼类的体色丰富多样,其遗传基础与决定机制也十分复杂。黑色体色是鱼类的一种普遍体色形式,由黑色素通路的一系列基因协同调控。酪氨酸（Tyrosinase,TYR）基因是黑色素合成通路中的关键基因,其突变会造成体色表型的显著变化,甚至白化现象。本论文以本实验室长期选育的瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var.color）为研究材料,结合模式生物斑马鱼（Danio rerio）,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除这两种鱼类的酪氨酸酶基因,观察敲除子代的体色变化,丰富和拓展了对酪氨酸酶基因的生物学功能认识,为深入研究瓯江彩鲤黑斑体色的形成与遗传机制积累了新资料。相关研究结果如下:1.瓯江彩鲤酪氨酸酶基因的结构分析和组织表达检测TYR基因是脊椎动物黑色素合成的关键基因,其表达量和活性水平对生物体黑色素的合成、种类和分布起重要调控作用。本章通过基因克隆获得了瓯江彩鲤两个TYR基因,其中TYR1基因包括CDS长1608bp,DNA长6755bp;TYR2基因包括CDS长1602bp,DNA长6426bp。TYR1和TYR2基因分别编码535和533个氨基酸,两者同源性高达94.95%,但仅TYR1基因保留有TRP基因家族特征蛋白区域。系统进化分析结果表明,瓯江彩鲤TYR基因与鲤科鱼类TYR基因聚为一大支,首先是瓯江彩鲤TYR1基因与鲫鱼聚为一支,然后与瓯江彩鲤TYR2基因聚为一支,最后与斑马鱼聚在一起,表明瓯江彩鲤TYR1基因与鲫鱼TYR为直系同源基因,TYR2基因可能是TYR1基因进化过程中的一个拷贝。6种皮肤荧光定量表达结果显示,两个基因在黑色皮肤中高表达,TYR1基因在“大花”中的表达量显著高于“粉花”（P<0.05）,而TYR2基因的表达量则是在“粉花”中的表达量显著高于“大花”（P<0.05）,说明两个基因在瓯江彩鲤“大花”和“粉花”中的体色调控方式存在差异,但具体调控机制需进一步研究。2.基因编辑技术对瓯江彩鲤酪氨酸基因的敲除TYR基因是动物体黑色体色形成的关键基因,该基因突变会导致动物出现不同程度的黑色缺失现象。本章通过应用CRISPR/Cas9基因编辑技术对“粉花”瓯江彩鲤TYR基因第一外显子进行敲除,构建F₀突变体,并进行其表型与基因突变类型的关联分析。敲除后的突变体表型结果表明:单独敲除TYR2基因后的瓯江彩鲤只表现出体表黑色斑块变浅,同时敲除2个TYR基因引起瓯江彩鲤眼部和体表黑色斑块出现不同程度的黑色素缺失,完全突变体表现为黑色素的完全缺失,皮肤体色与野生型“粉玉”彩鲤相同,4种类型的嵌合突变体全身出现不同程度的黑色素沉积。基因突变类型与表型的关联分析显示,两个TYR基因的突变率同时达100%,导致瓯江彩鲤的完全白化;任意一个基因的突变率未达100%,突变体可合成黑色素,形成黑色体表。完全突变体中下游基因表达结果显示,TYR基因突变引起突变体背部皮肤中两个TYRP1（TYRP1b、TYRP1c）基因和腹部皮肤DCT2的表达显著下降（P<0.05）,说明瓯江彩鲤TYR基因的突变影响下游基因的表达活性。本章结果表明,完全突变体皮肤体色虽与“粉玉”体色相同,但表现为眼睛也缺乏色素的完全白化现象,TYR基因可能不是“粉玉”形成的关键。3.基因编辑TYR基因不同功能区对斑马鱼体色的影响动物体中,基因功能的表达依赖于该基因蛋白的翻译,而翻译起始在很大程度上受CDS以及相对于CDS的上下游区域的影响。本章以AB系斑马鱼为研究对象,应用CRISPR/Cas9基因编辑技术,对纯合亲鱼受精卵进行显微注射,通过基因敲除TYR基因的CDS区第二外显子和3′-UTR非poly-A加尾信号区,使基因发生突变,检测基因不同功能区经编辑后对鱼类体色的影响。基因敲除后的表型结果显示:敲除TYR基因的CDS区后,突变型斑马鱼的胚胎和仔鱼均未出现黑色素细胞,表现为体表白化,而成鱼会再度出现黑色素细胞,表现为体表黑色条纹断裂。敲除损坏TYR基因的3′-UTR非poly-A加尾信号区后,突变型胚胎、仔鱼和成鱼均未出现黑色素减褪,黑色素合成未受影响。实验表明敲除损坏基因的CDS区会对生物表型产生显著影响,而敲除损坏3′-UTR非poly-A加尾信号区对生物表型的影响有限。TYR基因CDS区突变后的成鱼突变体中下游基因的表达结果显示,突变体皮肤条纹黑色素沉积越明显,TYRP1和DCT基因表达量越高。本章结果表明,斑马鱼成鱼黑色素的重新出现受下游基因的影响。