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乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)突变与肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的相关性一直是乙肝病毒致癌作用研究的热点。然而,从感染HBV到HCC,往往经历“慢乙肝-肝硬化-HCC”这一漫长过程,加之HBV基因组易于变异和宿主的免疫选择压力,感染者体内的HBV往往存在与“野生序列”高度相关但不完全相同的变异株的动态种群,即准种。这一现象提示我们,每一个体内HBV的突变往往随着感染时间和疾病进程而逐渐增加。在既往研究中,通过比较HBV感染不同时期的患者外周血中病毒的突变情况,发现了与HCC相关的HBV突变。但由于肝癌患者血清中的HBV突变来自于肝癌组织和非癌肝组织中的cccDNA突变,并且癌组织中病毒复制能力相对较弱。因此,血清中病毒DNA的突变不能有效地反映肝癌组织中HBV cccDNA的突变情况。HBV共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA,cccDNA)只存在于感染的肝细胞核中,是HBV复制的模板,具有一定的组织特异性。同时,为消除不同感染阶段这一时间因素对HBV变异程度的影响,本实验通过比较HCC患者配对的肝癌与癌旁组织中HBV cccDNA突变位点的差异,分析这些病毒突变的临床相关性,寻找与HCC发生、发展相关的病毒突变位点,开展与HCC发生、发展相关的病毒突变位点相应的功能研究,探索HBV基因组突变的可能致癌机制。本研究采用29例HCC患者术后的癌与癌旁组织,通过实时荧光定量PCR检测组织中HBV cccDNA和HBV total DNA水平,滚环扩增及PCR产物直接测序HBV cccDNA全基因组,与野生序列比对寻找HBV cccDNA的突变位点,并分析HBV cccDNA突变位点的临床相关性。以HBV 1.2×质粒为基础,通过定点突变技术,构建HBV 1.2×-G588C突变及HBV 1.2×-T1719G突变质粒,采用实时荧光定量PCR技术检测病毒突变位点对细胞内3.5kb RNA和total RNA及上清中HBV DNA水平的影响,用时间分辨荧光法检测病毒突变位点对细胞培养上清中HBs Ag和HBeAg含量的影响。采用双荧光素酶报告实验检测T1719G突变后是否对HBV Enh II的活性有影响,并进一步通过染色质免疫共沉淀技术(chromatin immunoprecipitation assay,Ch IP)-PCR技术检测T1719G突变后对HNF3β与EnhII之间结合力的影响。通过分别与野生型HBx质粒及HBx-T1719G突变型质粒共转染,检测T1719G突变的HBx蛋白对HBV复制能力的影响。研究结果如下:(1)完成了25个癌组织标本和29个癌旁组织标本中hbvcccdna的全基因组测序,其中有19对是配对的癌组织与癌旁组织。在19对hbvcccdna序列中,18对是c基因型,1对是b基因型。25个癌组织的hbvcccdna序列中23个是hbvc基因型。将所得到的18对c基因型的cccdna序列与hbv的野生序列进行比对,获得hbvcccdna全基因组的突变位点。以突变率大于10%的作为突变热点,共筛选出突变热点233个。完成了29对癌与癌旁组织hbvcccdna和totaldna的定量检测。(2)将23个癌组织中的各突变位点与患者的临床资料(术后生存时间,bclc分级、术前afp浓度等)及hbvdna定量结果进行了统计分析,结果显示t1719g、c1329a和t3098c突变与患者的术后生存时间相关,携带突变型a1329或c3098的肝癌患者术后生存时间长于携带野生型c1329或t3098的患者,而g1719突变组肝癌患者的术后生存时间短于t1719野生型组;g1078t、c1653t、g1727a、c1913a、t1978c和c3116t突变位点与患者术前高浓度的afp相关;t1719g和c1913a两个突变位点与hbvdna定量结果有统计学意义,其中,突变型g1719组hbvcccdna和hbvtotaldna含量均低于野生型t1719组,突变型a1913组hbvcccdna的含量高于野生型c1913组;我们还发现,突变位点t1719g与患者的bclc分级相关,t1719野生型组倾向于较低的bclc分级,g1719突变型组倾向于较高的bclc分级结果提示t1719g突变后患者的预后差;并且cox多因素分析结果显示t1719g突变是hcc患者术后生存时间的独立的危险预后预测因素,而t3098c突变是hcc患者术后生存时间的独立的保护预后因素。(3)g588c突变(可引起g145a氨基酸突变)只存在于3例癌组织(7c、569c、831c)中,提示g588c突变可能与hcc的发生发展有关。g588c突变型组上清中hbsag的含量低于野生型组(p<0.05),g588c突变型组细胞内的hbsag的含量高于野生型组(p<0.05),g588c突变型组hbsag的总量和hbv1.2×野生型组之间的差异无统计学意义(p>0.05),而g588c突变型组上清中hbsag与细胞内hbsag的比值明显低于hbv1.2×野生型组(p<0.05),并且,g588c突变型组上清中hbvdna水平与hbv1.2×野生型组之间的差异无统计学意义(p>0.05)。结果表明g588c突变不影响hbv的复制能力,也不影响hbsag的表达,而可能影响了hbsag从细胞内向细胞外的分泌。(4)在huh7和hepg2肝癌细胞中,hbv1.2×-t1719g突变型质粒与hbv1.2×野生型质粒相比,可以明显降低培养上清中hbsag和hbeag的含量(p<0.001)、细胞内HBV total RNA和3.5kb RNA水平(p<0.001)、细胞培养上清中HBV DNA水平(p<0.001),双荧光素酶报告实验发现,在Huh7、HepG2、SK-Hep1和HEK293T四种肝癌细胞中,T1719G突变组的Enh II的活性低于野生型组(p<0.001),当野生型质粒和T1719G突变型质粒分别与HNF3β质粒共转染时,T1719G突变组的EnhII的活性也低于野生型组(p<0.001),提示T1719G突变既降低了EnhII活性,又影响了HNF3β对Enh II的转录调控活性。ChIP-PCR实验结果表明T1719G突变影响了HNF3β和HBV EnhII之间的结合力,突变型G1719与HNF3β之间的结合力弱于T1719与HNF3β之间的结合力。在Huh7和HepG2细胞中,当HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共同转染时,与未共转染组相比上清中HBsAg和HBe Ag的水平没有明显变化(p>0.05);但当HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共同转染时,与未共转染组相比,上清中HBsAg和HBeAg的水平仍然明显下降(p<0.001);并且,HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共转染组上清中的HBsAg和HBe Ag的水平低于HBV 1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组(p<0.001);而HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共转染组上清中的HBsAg和HBeAg的水平与HBV1.2×质粒与HBx质粒共转染组相比差异没有统计学意义(p>0.05);当HBV 1.2×和HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒或HBx-mut突变质粒共同转染时,与未共转染组相比上清中HBV DNA的水平都升高(p<0.001);但HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx-mut质粒共转染组上清中HBV DNA的水平低于HBV 1.2×质粒与HBx-mut质粒共转染组,差异有统计学意义(p<0.001);而HBV 1.2×-T1719G质粒与HBx质粒共转染组上清中HBV DNA的水平与HBV 1.2×质粒与HBx质粒共转染组相比,差异没有统计学意义(p>0.05)。这些结果表明T1719G突变可以降低HBV的复制能力,其中突变的HBV EnhII和突变的HBx蛋白都起到了重要的作用。结果表明癌与癌旁组织中存在差异趋势的突变位点有可能是HCC发生的重要病毒学因素,通过与临床信息分析找到了一些具有临床相关性的突变位点,G588C突变可能影响HBsAg的分泌,T1719G突变与患者的BCLC分级、患者的术后生存时间有关,是HCC患者术后生存时间的独立危险预测因素,并且T1719G与HBV的复制能力有关,通过细胞水平实验证实了T1719G突变可以降低HBV的复制能力。