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目的:新型信号分子Nel-like molecule-l(Nell-1)是诱导成骨细胞分化及骨形成的重要正调控因子,本课题组前期研究发现它在牙齿发育、牙髓细胞的分化及矿化过程中发挥了重要作用,但其具体分子机制尤其是有无胞内蛋白的参与还不明确。检索文献和String数据库分析蛋白之间的相互作用,已有文献证实Apoptosis related protein 3(APR3)是Nell-1的直接结合蛋白,它在细胞凋亡、自噬、还有成骨细胞分化、矿化及骨形成过程中发挥重要作用。近期有研究表明Nell-1介导的成骨细胞分化和矿化过程中有APR3的协同参与,起到重要正调控作用。由于成骨细胞与成牙本质细胞在蛋白表达谱及胚胎来源上具有相似性,本课题组对Nell-1介导的牙髓细胞分化和矿化过程中是否有APR3参与进行了探讨并对其信号路径机制进行了分析。方法:本课题首先利用Real-time PCR和Western blot技术检测了体外培养的人牙髓细胞内Nell-1和APR3的表达,通过细胞免疫荧光双染技术检测了 Nell-1和APR3在人牙髓细胞的亚细胞分布和共定位情况;利用免疫共沉淀技术和Western blot技术,检测了 Nell-1与APR3的相互作用关系,揭示Nell-1和APR3在人牙髓细胞内的表达模式。成功构建并转染慢病毒表达载体(pCDH-Nell-1、pCDH-APR3、pCDH-A-N)和沉默载体shRNA-APR3,以正常培养牙髓细胞和感染空载体细胞作为对照,分别感染牙髓细胞后,通过CCK-8检测细胞周期和Cyclin D1蛋白表达变化,检测APR3对牙髓细胞增殖和分化的影响。利用碱性磷酸酶(ALP)活性、茜素红染色、RT-PCR技术及Western blot技术等检测了Nell-1和APR3对牙髓细胞分化和矿化的影响。结果:Real-time PCR和Western blot技术结果表明Nell-1和APR3的RNA及蛋白水平在牙髓细胞的分化及矿化过程中表达上调;细胞免疫双荧光结果证实了Nell-1和APR3在牙髓细胞内的分布和表达情况,共定位分析二者可以在同一位置表达;Nell-1结合APR3通过Cyclin D1蛋白可以抑制牙髓细胞的增殖;慢病毒分别感染牙髓细胞后,ALP活性检测、茜素红染色和RT-PCR检测相关矿化基因结果提示,Nell-1可以协同APR3促进了人牙髓细胞的碱性磷酸酶表达上调、促进了矿化结节的形成及分化相关因子BSP、DSPP、OPN的表达上调。结论:Nell-1可以协同APR3促进牙髓细胞向成牙本质细胞分化和矿化;Nell-1结合APR3可部分通过Cyclin D1抑制细胞周期,进而抑制牙髓细胞的增殖。该研究为探讨牙本质形成及牙髓损伤修复领域奠定了一定的实验室基础及理论依据。