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石系亚1号是二倍体亚洲棉,基因组A2,遗传性状稳定,抗枯萎病,耐瘠薄,耐旱抗寒,不易脱铃烂铃,相当于亚洲棉的标准系。为了充分发掘控制石系亚1号优良性状的基因,并对石系亚1号进行功能基因组学研究,利用二倍体亚洲棉石系亚1号为材料,建立了石系亚1号全生育期的均一化全长cDNA文库。 为尽量包含石系亚1号不同时空表达的基因,根据形态及发育状况对石系亚1号不同发育时期的各种组织器官进行了多次取样,确保了样品的完整性。具体是:子叶期整株取样两次;1-7片真叶的整株各一株;苗期、蕾期、花铃期的叶片和花;现蕾5、10、15、20、25天的蕾;现花3、5、10、15、20天的铃;共6部分材料。采用改良的CTAB法成功地提取了上述材料的总RNA。为了避免rRNA给建库带来的干扰,用Oligotex mRNA Mini Kit纯化出了mRNA,通过SMART法反转录获得全长双链cDNA,保证了cDNA的完整性。 为了尽可能多的得到石系亚1号全生育期表达的各种基因,将石系亚1号不同时空表达的所有基因尽可能的包含在文库中,同时能够把高表达的持家基因的丰度降低。将来自6部分材料的cDNA混合到一起,利用DSN法对其进行了均一化。均一化之后,将双链cDNA末端削平,加上含有EcoRI酶切位点的衔接子（linker）,使用EcoRI酶切之后,回收大小在500bp-4000bp之间的cDNA片断。将回收的片断连接到λZAPⅡ载体,用Gigapack Ⅲ XL包装蛋白对连接产物进行包装,即构建了石系亚1号全生育期的均一化全长cDNA文库。经过检测,初级文库的滴度达到2×106pfu/ml,重组率为90%,插入片断平均长度大于1kb,初级文库的质量符合要求。对初级文库进行了扩增,扩增文库的滴度达到了5×109pfu/ml,文库的质量符合要求。 为了验证该库的质量,利用植物抗病基因保守区设计了6对简并引物,用PCR的方法从cDNA文库中扩增出了6条抗病基因同源序列（RGA）。对简并引物对6获得的序列测序,得到了一条273bp的RGA片断。使用BlastN在Genbank中比对,发现它与编码拟南芥细胞膜上的载体蛋白的mRNA有很高的相似性,相似性达到了82%,该蛋白负责胞内物质运输。蛋白翻译表明该RGA编码的蛋白质富含亮氨酸,推测其可能是跨膜蛋白,具有信号传导的作用,极有可能与抗病有关。对其进行组织特异表达验证,证明它在各种组织器官中均有表达,且表达量基本相同,可以认为它是组成型表达的。将测得的序列提交到Genbank,登录号:DQ668368。 均一化全长cDNA文库为石系亚1号的功能基因组研究提供了一个良好的工作平台,为研究石系亚1号发育相关的基因提供了基础,增加了发掘各种稀有基因的可能性,同时可以用于EST计划,为进一步测序以建立棉花的EST数据库奠定了基础,这将为棉花基因克隆和功能基因组研究奠定很好的基础平台。