我们实验室之前的研究表明骨桥蛋白(OPN)是促进肝细胞肝癌侵袭转移的关键分子之一,并且通过体内外试验确定为干预肝细胞肝癌侵袭转移潜在的靶点。而丝氨酸蛋白酶凝血酶能和骨桥蛋白相互作用并且调节它的生物活性。为了研究凝血酶单独以及与骨桥蛋白协同在肝细胞肝癌的作用,我们在具有不同的骨桥蛋白表达水平肝癌患者中,研究了凝血酶的表达水平与不同骨桥蛋白背景的肝癌患者预后的联系。我们发现凝血酶的表达水平与肝癌细胞株的转移潜能密切相关,并且与癌旁组织相比,癌组织的凝血酶表达水平显著上升。另外,发生复发的患者的癌组织与未复发的患者相比,凝血酶的表达水平显著升高。对230例患者的免疫组化研究表明,只有骨桥蛋白表达水平较高的患者,凝血酶的表达水平才与患者的总体生存(OS；P<0.01)与至复发时间(TTR；P<0.0001)相关。体外试验表明,凝血酶能够有效促进骨桥蛋白过表达肝癌细胞株的增殖和黏附能力,体内试验证明凝血酶有效促进了人肝癌细胞在裸鼠体内的肺转移,同时人肝癌裸鼠体内肺转移可被凝血酶抑制剂阿加曲班所抑制。并且在体外观察了原核表达的骨桥蛋白全长与凝血酶切片段对肝癌细胞增殖与黏附能力的影响,发现氨基端片段比全长拥有更强的促增殖与黏附能力。同时外源性凝血酶的处理能够激活骨桥蛋白高表达细胞株FAK信号通路,并且这种激活效应能够被整合素拮抗性抗体所阻断。结论：凝血酶在骨桥蛋白介导的侵袭性表型和肝细胞肝癌较差预后中发挥重要作用,这种作用可能是通过激活整合素受体-FAK信号通路引起的。因此,凝血酶可能是对抗凝血酶骨桥蛋白双阳性患者侵袭转移潜在的靶点。第一部分凝血酶在肝细胞肝癌中高表达目的：通过检测肝癌组织、癌旁和正常肝组织中凝血酶的mRNA与蛋白表达以及不同转移潜能肝癌细胞以及正常肝细胞凝血酶的mRNA与蛋白表达,分析其与肝癌恶性行为的关系。方法：应用荧光定量PCR、免疫组织化学技术以及Western blot检测凝血酶在肝癌、相应癌旁、正常肝组织中的表达,并比较三组间凝血酶的表达差异；应用荧光定量PCR及Western blot检测不同转移潜能肝癌细胞以及正常肝细胞凝血酶的mRNA与蛋白表达,比较不同细胞株之间凝血酶的表达差异。结果：通过荧光定量PCR以及Western blot技术,发现六株肝癌细胞株与正常肝细胞株(L-02和Chang liver细胞株)相比,凝血酶的mRNA和蛋白表达水平显著上调。以HepG2. PLC和MHCC97-L细胞株为代表的低转移潜能肝癌细胞和以MHCC97-H、HCCLM3和HCCLM6为代表的高转移潜能肝癌细胞株与低转移潜能肝癌细胞株相比,高转移潜能细胞株凝血酶的ⅠnRNA和蛋白表达水平显著上调(P<0.0001)。我们通过荧光定量PCR同时检测了20例正常肝脏组织和72例肝癌组织以及相应的癌旁组织凝血酶mRNA的表达水平。凝血酶在肝癌、相应癌旁和正常肝组织中均有表达,相对表达量分别为(2-△Ct,137.4±69.1),2.7±0.1(0.0-6.5)与1.8±0.8(0.0-3.1),肝癌与相应癌旁组织间差异明显(P=0.005),凝血酶在癌旁与正常肝组织的表达也存在差异(2-△Ct,分别为22.2±7.6和19.9±8.7)(p<0.05)。同时,凝血酶在肝癌组织mRNA的表达水平与肝癌复发正相关(P=0.037),这点得到了Western blot结果的验证。免疫组织化学显示凝血酶主要分布于细胞周质,其在肝癌组织中的表达明显高于癌旁(p<0.05)。结论：凝血酶在肝癌细胞株以及肝癌组织中高表达,并且凝血酶在肝癌的恶性行为中可能具有重要作用。第二部分凝血酶/骨桥蛋白与肝癌临床病理特征及预后的关系目的：研究凝血酶和骨桥蛋白在原发性肝癌中表达,探讨凝血酶和OPN与原发性肝癌侵袭转移的关系及临床生物学意义。方法：应用荧光定量PCR检测72例肝癌组织中凝血酶与OPN mRNA的表达,免疫组织化学技术检测230例肝癌组织中凝血酶与骨桥蛋白的表达,SSPS15.0分析两者与肝癌临床病理特征及预后的关系。结果：肝癌组织凝血酶和骨桥蛋白mRNA表达水平的相关性分析表明,它们的表达量并不存在联系(r=-0.17,p＝0.15)。为了观察凝血酶是否参与了骨桥蛋白相关肝癌患者的预后,我们根据骨桥蛋白表达水平的中位值作为阈值将肝癌患者分为低表达和高表达组。发现在骨桥蛋白高表达组,复发患者的凝血酶表达水平比未复发的患者显著提高(P=0.027)。这样的差异并没有出现在骨桥蛋白低表达组患者中(P=0.457)。我们用免疫组化技术在230例肝癌患者中评估凝血酶和骨桥蛋白在肝癌中的蛋白表达水平,并且分析了与他们的预后的关系。凝血酶和骨桥蛋白的阳性率分别为33%(77/230)和39%(90/230)。其中15.7%(36/230)的患者同时阳性标记。我们发现凝血酶过表达与肝癌患者的肿瘤大小(P=0.0438)、血管侵犯(P=0.0317)、TNM(P=0.0187)分期等临床病理因素有关。在骨桥蛋白过表达的患者组中,凝血酶过表达与血清AFP(P=0.0304)、肿瘤大小(P=0.0024)、血管侵犯(P=0.0018)、TNM分期(P=0.0008)、肿瘤分化(P=0.0373)以及肿瘤包膜完整(P=0.0477)相关。但是,在骨桥蛋白低表达患者组中并没有发现凝血酶过表达与这些临床病理特征之间的联系。凝血酶蛋白水平的过表达与至复发时间显著相关(P=0.021),并且在骨桥蛋白过表达患者组中这种联系更强(P=0.0001),而在骨桥蛋白低表达患者组中并没有发现这种联系(P=0.728)。凝血酶过表达的肝癌患者1-,3-和5-年累积复发率分别为41.6,67.5和68.8%,显著高于凝血酶低表达的肝癌患者(24.8,43.1和47.1%；P=0.0001)。凝血酶过表达的肝癌患者1-,3-,5-年总生存率分别为75.3,42.9和40.2%,显著低于凝血酶低表达的肝癌患者(85.6,59.5和57.5%；P=0.005)。将230例肝癌患者根据骨桥蛋白的表达水平分为骨桥蛋白过表达组与低表达组,在骨桥蛋白过表达组中,凝血酶的过表达患者(thrombin+/OPN+)与低表达患者(thrombin+/thrombin-)相比,至复发时间更短(P=0.001),1-,3-和5-年累积复发率(47.2,86.1和88.9%)显著高于低表达组患者(20.4,42.6和46.4%；P<0.0001)。thrombin+/OPN+组患者1-,3-,5-年的总生存率(72.2,27.8和22.2%)显著低于thrombin-/OPN+组患者(85.2,61.1和55.2%,P=0.001)。而在骨桥蛋白低表达患者组中,凝血酶表达水平的差异与生存和复发并无联系(TTR, P= 0.728; OS, P= 0.596)。结论：凝血酶／骨桥蛋白过表达可以预测肝细胞肝癌的预后,凝血酶可能参与了骨桥蛋白介导的肝癌恶性表型。第三部分凝血酶促进骨桥蛋白阳性肝癌细胞的侵袭与转移目的：研究凝血酶与骨桥蛋白阳性肝癌细胞侵袭与转移的关系方法：转染pOPN-GFP质粒和Pegfp-N1对照质粒,筛选出稳定细胞株,经westernblot和荧光倒置显微镜验证筛选出的稳定细胞株；CCK-8检测加入外源性的凝血酶后对不同骨桥蛋白表达水平肝癌细胞增殖能力的变化；细胞外基质试剂盒研究加入外源性的凝血酶后,不同骨桥蛋白表达水平细胞黏附能力的改变；细胞经尾静脉注射途径注入裸鼠体内,研究外源性的凝血酶对不同OPN表达水平肝癌细胞肺转移能力的改变；高转移潜能肝癌细胞株HCCLM3接种于裸鼠皮下,研究凝血酶抑制剂阿加曲班的干预对细胞成瘤与肺转移能力的改变。结果：低转移潜能肝癌细胞株PLC稳定转染野生型OPN真核质粒及对照空白对照质粒,OPN的蛋白表达水平通过Western blot验证后,分别命名为PLC-OPN和PLC-CON。PLC-OPN与PLC-CON细胞株相比,OPN表达水平显著上调。体外增殖试验观察两个细胞株对凝血酶的处理(2 U/m1)的反应差别,发现PLC-CON和PLC-OPN细胞株在普通培养条件下具有相似的增殖动力学。而凝血酶处理后,PLC-OPN细胞株在对数生长期的增殖显著上调(P<0.05),而PLC-CON细胞株并没有出现这种增殖能力的改变。体外黏附试评估了PLC-CON和PLC-OPN细胞株凝血酶(2 U/m1)处理后,黏附能力的改变。发现,凝血酶的处理显著增强了PLC-OPN细胞株对细胞外基质分子的黏附能力,而PLC-CON并没有发生这种改变。为了进一步研究凝血酶影响体内肝癌肺转移的效应,2 U/ml凝血酶处理过的PLC-OPN/PLC-CON细胞株通过尾静脉注射注入裸鼠体内,四周后处死裸鼠观察肺转移率和肺转移个数。尽管每只裸鼠都发生肺转移,PLC-OPN细胞凝血酶处理组单个裸鼠平均肺转移个数显著高于非处理组(P<0.05)。然而,PLC-CON细胞处理组和非处理组并没有显著差别。体内凝血酶抑制剂阿加曲班的干预,显著降低了肝癌细胞的肺转移率以及肺转移造的数量,而对成瘤并无影响。HCCLM3肝癌细胞接种裸鼠皮下成瘤,10天后干预组接受凝血酶抑制剂阿加曲班的干预,对原发瘤大小并无显著影响。六周后处死裸鼠观察肺转移率和肺转移个数,发现对照组裸鼠都发生肺转移,平均肺转移个数为16.7±8,以Ⅰ-Ⅱ期转移灶为主,含部分Ⅲ-Ⅳ转移灶。相反的是,干预组中只有一半的裸鼠发生肺转移,且平均肺转移个数为5.2±2.5,大部分为Ⅰ期转移灶。结论：凝血酶通过调节骨桥蛋白过表达肝癌细胞株的增殖与黏附能力促进肝癌的侵袭与转移。第四部分凝血酶对整合素受体β1/FAK信号转导的影响目的：研究凝血酶与骨桥蛋白在肝癌细胞中的关系及对整合素受体β1/FAK信号的影响方法：原核表达骨桥蛋白全长以及凝血酶切片段三株蛋白,观察三株蛋白在促肝癌细胞增殖及黏附能力的差别；以凝血酶作用于OPN不同表达水平的细胞,western blot研究整合素受体β1/FAK信号通路分子总蛋白以及磷酸化的差异,分析其在肝癌细胞中对整合素受体β1/FAK信号的影响。结果：原核重组OPN全长与氨基端片段都能显著促进对数生长期的增殖能力(P<0.05),但氨基端片段比全长具有更显著的促增殖能力(P<0.05),但是羧基端片段对细胞增殖并没有影响。纯化好的原核重组OPN全长以及片段包被96孔板,然后比较它们对PLC-CON细胞不同的黏附能力。与OPN全长相比,氨基端片段显示出更强的黏附能力(P<0.05),而羧基端片段与对照BSA相比并没有显示出黏附能力。凝血酶作用后,OPN过表达的细胞中整合素受体β1 mRNA的表达水平显著上升,其下游的FAK磷酸化水平显著上调,并呈现剂量依赖性,在2 U/ml浓度时FAK的磷酸化达到峰值,而OPN低表达的细胞中不存在这些变化。我们同时发现FAK总蛋白表达水平在两株细胞干预组中发生改变。而整合素受体β1拮抗性抗体AIIB2(10μg/ml)可以显著抑制凝血酶引起的FAK磷酸化。结论：凝血酶通过激活整合素受体β1/FAK信号通路促进OPN过表达肝癌细胞的侵袭转移。全文总结1。凝血酶在肝细胞肝癌中上调；2.凝血酶与骨桥蛋白介导的肝细胞肝癌的恶性表型和不良预后相关；3.凝血酶通过激活整合素-β1/FAK通路提高了骨桥蛋白阳性肝癌细胞的增殖与侵袭能力。4.凝血酶是干预骨桥蛋白阳性肝癌患者的潜在的靶点。潜在应用价值1.凝血酶的表达水平可以预测肝癌患者的预后,特别是在骨桥蛋白过表达的患者中更有意义。2.凝血酶是治疗转移性骨桥蛋白过表达肝细胞肝癌的治疗靶点。3.凝血酶有可能是治疗转移性骨桥蛋白过表达恶性肿瘤的治疗靶点。创新点1.首次报道了凝血酶的表达水平与肝细胞肝癌的恶性行为相关。凝血酶的表达水平与肝癌患者尤其是骨桥蛋白过表达患者的转移潜能以及复发密切相关,并且影响肝癌患者的至复发时间(TTR)和生存。2.首次报道了凝血酶在骨桥蛋白过表达肝癌患者预后判断的重要作用,并且提供了对这部分患者干预的重要靶点。体内和体外试验表明凝血酶显著促进了骨桥蛋白过表达肝癌细胞株的增殖与黏附能力,并且促进裸鼠肺转移的能力可被凝血酶抑制剂所阻断。3.首次报道了凝血酶可以激活FAK的磷酸化,而这种效应可被整合素β1的拮抗性抗体所阻断。这表明凝血酶有可能是是干预骨桥蛋白过表达肝癌患者转移潜在的靶点。