【摘 要】
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目的不同灭菌方式建立PM2.5体外暴露损伤气道上皮细胞模型,证实新型程序性死亡——细胞焦亡在气道上皮细胞的发生。评价PM2.5对气道上皮炎症损伤、细胞焦亡的影响,并通过生信分析预测哮喘发生发展与细胞焦亡的相关性。方法采集广州地区PM2.5,分紫外灭菌和高压灭菌两组预处理,用电感耦联等离子质谱、离子色谱等方法对组分进行分析。制备PM2.5悬液,分不同质量浓度,低浓度组(100μg/ml)和高浓度组(
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目的不同灭菌方式建立PM2.5体外暴露损伤气道上皮细胞模型,证实新型程序性死亡——细胞焦亡在气道上皮细胞的发生。评价PM2.5对气道上皮炎症损伤、细胞焦亡的影响,并通过生信分析预测哮喘发生发展与细胞焦亡的相关性。方法采集广州地区PM2.5,分紫外灭菌和高压灭菌两组预处理,用电感耦联等离子质谱、离子色谱等方法对组分进行分析。制备PM2.5悬液,分不同质量浓度,低浓度组(100μg/ml)和高浓度组(200μg/ml)刺激人正常支气管上皮BEAS-2B细胞株:1)CCK8法测定PM2.5处理对细胞增殖影响,绘制不同浓度、时间反应曲线;光学显微镜及流式细胞术观察细胞死亡情况;2)扫描电镜观察细胞焦亡形态:有无细胞胀大、细胞膜破裂,胞质内容物释放;3)RT-PCR、Western blot测定焦亡相关分子(NLRP3、Caspase-1、-4、-5、GSDMD、IL-1β、IL-18)及炎症因子(TNF-α、IL-10)m RNA与蛋白水平的表达;4)挖掘GEO数据库,筛选差异表达基因,通过功能富集分析预测哮喘与细胞焦亡相关性。结果紫外灭菌和高压灭菌处理,PM2.5水溶性离子、重金属、总有机碳、碳组分组成无明显差异。生信筛选出细胞焦亡通路核心分子NLRP3作为哮喘核心显著上调基因之一。PM2.5处理气道上皮24小时:1)与对照组相比,实验组光镜、CCK8及流式细胞术下均可观察到气道上皮细胞死亡增多;2)紫外灭菌组与对照组相比RT-PCR观察炎症指标IL-10(P=0.0024;P=0.0028)、TNF-α(P=0.0034;P=0.0048)m RAN明显增加;Western blot提示紫外灭菌组TLR4、PARP、COX2、p-p38、Bcl-2等明显激活,高压灭菌组NF-κB激活为主;3)实验组扫描电镜可观察到细胞呈现凹凸不平的状态,符合焦亡形态学改变;相比对照组,紫外灭菌组与高压灭菌组RT-PCR(NLRP3、IL-1β、IL-18、Caspase-1、Caspase-4、Caspase-5、GSDMD)表达均增加,但倍数存在差异;Western blot提示紫外灭菌组以炎症小体NLRP3激活为主,高压灭菌组以Caspase-1、IL-1β、Cleaved-gasdermin激活为主。结论。PM2.5刺激24小时诱导气道上皮细胞死亡,抑制细胞增殖,激活炎症因子TNF-α与IL-10m RNA及炎症通路NF-κB信号通路,诱导NLRP3/Caspase-1介导的细胞焦亡发生。但PM2.5灭菌方式不同,上述结果可能存在部分差异;细胞焦亡通路核心分子NLRP3作为GSE137268数据集核心显著上调基因之一,参与哮喘的发生发展。
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