芪蓟肾康汤对AngⅡ诱导人肾小球系膜细胞增殖及Col-Ⅳ、IL-6、Smads表达的影响

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目的:本实验研究以揭示芪蓟肾康汤(专利号:ZL 2011 1 0103377.6)防治IgA肾病的作用机理为目的,探讨芪蓟肾康汤抑制血管紧张素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)诱导人肾小球系膜细胞(Human Mesangial cell,HMC)增殖的作用途径及观察对Ⅳ型胶原蛋白(collageⅣ,Col-Ⅳ)、白介素6(Interleukin 6,IL-6)、Smads家族蛋白的影响。方法:1.含药血清制备:将40只雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分成5组,分别为正常组、西药对照组、芪蓟肾康汤低剂量组、芪蓟肾康汤中剂量组、芪蓟肾康汤高剂量组,连续灌胃给药一周后,腹主动脉采集血液。血液使用离心机3000r离心20分钟,吸取上清液,经30分钟56℃水浴灭活处理,用过滤器过滤除菌后,放置在-20℃保存,以备后用。2.人肾小球系膜细胞的培养、增殖、分组:将人肾小球系膜细胞接种于75cm2培养瓶中,加入含10%FBS的RPMI-1640培养液,放置于37℃、5%CO2培养箱中进行培养;以血管紧张素Ⅱ作为诱导因子使人肾小球系膜细胞增殖;系膜细胞的分组如下:(1)正常组、(2)模型组、(3)西药对照组、(4)中药低剂量组、(5)中药中剂量组、(6)中药高剂量组。3.检测方法:(1)光学显微镜下观察及四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)观察细胞增殖;(2)酶联免疫吸附法(ELISA)检测各分组HMC上清液中COL-Ⅳ含量;(3)采用实时荧光定量PCR检测IL-6mRNA与Smad2mRNA、Smad7mRNA与的表达。结果:1.光学显微镜镜下观察显示:人肾小球系膜细胞明显增殖;2.MTT法显示:芪蓟肾康汤各剂量组能使HMC增殖减少,但低剂量组与模型组没有显着差异(p>0.05)、与西药对照组比较均有明显差异(p<0.01)。3.ELISA法显示:每组增殖的HMC中上清液中COL-Ⅳ含量结果,与正常组相比,模型组中的COL-Ⅳ含量有明显差异(p<0.01);与模型组比较,西药对照组、芪蓟肾康汤低、中、高剂量组均有明显差异(p<0.01);与西药对照组比较,芪蓟肾康汤低、中、高剂量组比较均有差异(p<0.05);芪蓟肾康汤各组内比较有差异(p<0.01)。4.实时荧光定量PCR法显示:(1)与模型组相比较:芪蓟肾康汤各剂量组IL-6mRNA、Smad2mRNA表达下降均有明显差异(p<0.01),Smad7mRNA表达上升有明显差异(p<0.01);(2)IL-6mRNA表达:与西药对照组比较,芪蓟肾康汤低剂量组和高剂量组IL-6mRNA表达差异均不明显(p>0.05),中剂量组IL-6mRNA表达有差异(p<0.05);(3)Smad2mRNA表达:与西药对照组比较,芪蓟肾康汤低剂量组和高剂量组差异不明显(p>0.05),中剂量组Smad2mRNA表达有差异(p<0.05);(4)Smad7mRNA表达:与西药对照组比较,芪蓟肾康汤各剂量组均有差异(p<0.05),中剂量组有明显差异(p<0.01)。结论:1.AngⅡ可诱导人肾小球系膜细胞增殖。2.阐明芪蓟肾康汤抑制人肾小球系膜细胞增殖作用的靶点可能是Col-Ⅳ、IL-6及Smads家族蛋白。3.阐明芪蓟肾康汤防治IgA肾病机理:通过抑制Smad2mRNA表达、促进Smad7mRNA表达,抑制了TGF-β1/Smads信号传导通路,使人肾小球系膜细胞中Col-Ⅳ含量减少,抑制IL-6mRNA的表达,抑制人肾小球系膜细胞增殖,改变IgA肾病的病理状态,防止IgA肾病进一步恶化。
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