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第一部分筛选vemurafenib耐药的黑素瘤细胞的microRNA表达 目的：在vemurafenib耐药的黑素瘤细胞中筛选并找到能逆转耐药的microRNA。 方法：建立在高浓度vemurafenib中稳定生长的耐药A375细胞株（下文均称之为RA375），筛选vemurafenib耐药RA375和原始A375细胞的差异microRNAs，进行qPCR验证。在耐药细胞RA375中进行Lipofectamine2000转染差异表达的microRNA模拟物或抑制物。CCK8法检测加入vemurafenib后，转染差异表达microRNA模拟物或抑制物的耐药细胞RA375的细胞活力。 结果：与原始A375细胞相比，耐药细胞RA375中有十个microRNAs表达上升:mir-514-3p，mir-129-1-3p，mir-509-3p，mir-629-3p，mir-937-5p，mir-3960，mir-1915-3p，mir-4281，mir-4634，mir-6090;同时还发现七个microRNAs表达下降：mir-19b-3p，mir-20a-5p，mir-17-5p，mir-20b-5p，mir-19a-3p，mir-18a-5p，mir-7（p﹤0.05）。其中，在耐药细胞RA375中转染mir-7 mimics后能逆转耐药（p﹤0.05）。结论： mir-7在耐药细胞RA375中低表达，mir-7可能参与逆转黑素瘤细胞对vemurafenib耐药。 第二部分 vemurafenib耐药的黑素瘤细胞内MAPK和PI3K/AKT信号通路的情况 目的：研究vemurafenib耐药的黑素瘤细胞RA375中MAPK和PI3K/AKT信号通路情况。 方法： Western Blot方法比较原始A375细胞和耐药细胞RA375受不同浓度vemurafenib作用后细胞内MEK，ERK和AKT磷酸化的蛋白水平差异。Western Blot方法比较原始A375细胞和耐药细胞RA375细胞内ERK和AKT磷酸化的蛋白水平差异。 结果：随着vemurafenib剂量逐渐增加，72小时后，原始A375中MEK和ERK磷酸化蛋白水平逐渐下降，而磷酸化AKT蛋白水平逐渐升高。随着vemurafenib剂量逐渐增加，72小时后，耐药细胞RA375中MEK和ERK磷酸化蛋白水平无明显下降，而磷酸化AKT蛋白水平维持不变。与原始A375细胞相比，耐药细胞RA375中ERK的磷酸化蛋白水平升高；AKT的磷酸化蛋白水平略下降。结论： vemurafenib耐药的黑素瘤细胞RA375中，MAPK和PI3K/AKT这两条信号通路活化，可能参与耐药机制。 第三部分 Mir-7通过降低MAPK和PI3K/AKT信号通路的活化而逆转黑素瘤对vemurafenib的耐药 目的：探索mir-7在vemurafenib耐药的黑素瘤细胞中的作用与机制。 方法： Western Blot方法检测mir-7 mimics转染耐药RA375细胞后细胞内ERK和AKT磷酸化蛋白水平；mir-7 mimics转染耐药细胞RA375后皮下种植瘤体，比较一周后成瘤体积大小。 结果：与scramble组相比，过表达mir-7的耐药细胞RA375在转染72小时后细胞内ERK和AKT磷酸化蛋白水平下降；裸鼠皮下种植过表达mir-7的耐药细胞RA375一周后均成瘤，与scramble组相比，mir-7组可以抑制肿瘤生长（p﹤0.05）。 结论： mir-7可能通过降低MAPK和PI3K/AKT信号通路的活化而逆转黑素瘤对vemurafenib的耐药。 第四部分多个mir-7的靶基因参与调控黑素瘤对vemurafenib耐药的机制 目的：进一步探索mir-7经抑制MAPK和PI3K/AKT信号通路的活化而逆转黑素瘤对vemurafenib的耐药机制。 方法：Real-time PCR和Western Blot方法分别检测原始A375和耐药细胞RA375内EGFR、IGF-1R和CRAF三个基因的mRNA和蛋白水平；Real-time PCR和Western Blot方法分别检测过表达mir-7的耐药细胞RA375内EGFR、IGF-1R和CRAF三个基因的mRNA和蛋白水平；CCK8法检测在耐药细胞RA375中转染EGFR、IGF-1R和CRAF这三个基因的siRNA后耐药细胞RA375的细胞活力；选用针对这三种基因的小分子抑制剂，EGFR抑制剂 gefitinib，IGF-1R抑制剂linsitinib，CRAF抑制剂 GW5074。CCK8法检测在这三种抑制剂对耐药细胞RA375的细胞活力影响。结晶紫染色观察这三种抑制剂对耐药细胞RA375的细胞增殖影响。Western Blot方法检测应用这三种抑制剂后，耐药细胞RA375中的ERK和AKT磷酸化蛋白水平的变化。 结果：与原始A375细胞相比，耐药细胞RA375中EGFR、IGF-1R和CRAF三个基因的mRNA和蛋白水平均上升；与scramble组相比，过表达mir-7的耐药细胞RA375中EGFR、IGF-1R和CRAF这三个基因的mRNA和蛋白水平均明显降低。转染IGF-1R siRNA后对耐药细胞RA375有轻度逆转耐药作用（p﹤0.05），转染EGFR和IGF-1R的siRNA后对耐药细胞RA375的逆转耐药作用不明显。Gefitinib，linsitinib，GW5074三种抑制剂联合使用对逆转耐药效果最为明显（p﹤0.05），并可降低耐药细胞RA375内ERK和AKT的磷酸化蛋白水平。 结论： mir-7可能通过下调EGFR、IGF-1R和CRAF这三个基因的表达，进一步抑制MAPK和PI3K/AKT的活化水平，达到逆转黑素瘤对vemurafenib耐药的作用。