研究背景抗HIV抗体的检测是目前HIV诊断最常用的方法。但是,机体感染HIV后,首先出现病毒核酸,其次是抗原,然后出现抗体。也就是说,在HIV感染的早期,并不能检测到抗HIV抗体,HIV核酸和抗原是早期感染的主要标志物。HIV核酸的检测具有很高的灵敏性和特异性,但由于其基因的高度变异以及对人员、设备和技术的较高要求,使得核酸检测受到一定的限制。HIV-1抗原检测,因其较核酸检测具有一定的优势,而受到广泛的关注,被用于HIV-1感染的早期诊断、血液筛查、监测疾病进展及评估治疗效果。目前检测HIV-1p24抗原常用的方法是酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA),该方法操作简便、技术成熟、自动化程度高,在HIV实验室中应用极其广泛,但是,其灵敏度却无法满足疾病早期诊断和痕量检测的要求。随着纳米材料和技术的迅猛发展,纳米生物条形码技术检测微量蛋白以极高的灵敏度受到广泛关注。该方法基于两种探针,一种是磁性探针,在磁性微球表面包被有针对靶蛋白的一个识别元件；另一种是金纳米探针,在金纳米粒子表面修饰有另一个识别元件以及作为信号鉴定的寡核苷酸——条形码DNA,两种探针上的两个识别元件分别与靶蛋白形成夹心复合物,对复合物上的条形码DNA进行鉴定继而推断出靶蛋白的水平。这种技术将DNA标记技术与目标蛋白结合,再将与蛋白识别过程相关的信号放大,最后通过标记DNA的鉴定实现蛋白定量,为生物标记物的高灵敏度检测提供了新的技术平台,在生物分子检测、传染病监测、肿瘤早期发现和监测等各个方面都有着广泛的应用。本文尝试建立了两种形式的纳米生物条形码技术,分别是磁性微球式和微孔板式,同时结合PCR技术来检测HIV-1p24抗原,以期达到较高的检测灵敏度。研究目的1、挑选出抗HIV-1p24抗原的单克隆抗体,并进行配对筛选,同时,应用筛选出的配对抗体构建夹心ELISA法检测HIV-1p24抗原,判断其检测灵敏度；2、以筛选出的配对抗体为基础,初步建立纳米生物条形码技术检测HIV-1p24抗原的方法,同时在终端检测方面引入PCR技术进行条形码DNA的鉴定,以期显著提高HIV-1p24抗原检测的灵敏度；3、尝试将传统磁性微球替换为微孔板来捕获待测抗原,建立基于微孔板的纳米生物条形码技术检测HIV-1p24抗原的方法,为开发用于HIV感染早期诊断的有效方法提供技术平台。研究方法1、根据夹心ELISA法挑选抗HIV-1p24抗原的配对单克隆抗体的原则,筛选抗体,并且采用直接和间接ELISA法对包被抗体和酶标抗体进行选择；2、以配对抗体构建夹心ELISA法检测HIV-1p24抗原,探索关键技术条件并确定检测流程,最终确定检测灵敏度及检测范围；3、挑选拟南芥基因组中一段47bp的DNA作为条形码DNA,在与之互补的序列5’端修饰巯基作为捕获DNA。同时,设计针对条形码DNA扩增的引物,并确定PCR及SybreGreen荧光定量PCR扩增的最适条件；4、在金纳米粒子表面连接检测抗体,并将两种DNA互补杂交形成的双链DNA通过疏基与金纳米粒子表面相连,制成金纳米探针；5、将单抗1G12包被于磁性微球表面,制成磁性探针,捕获待检的HIV-1p24抗原,然后与金纳米探针夹心结合,将夹心复合物上的的条形码DNA通过加热解离下来作为检测信号,进行PCR检测及4%琼脂糖凝胶电泳分析,将结果ELISA法灵敏度及线性检测范围进行比较；6、微孔板上包被单抗1G12,固相捕获待检的HIV-1p24抗原或病毒培养上清,然后与包被有单抗1D4和条形码DNA的金纳米探针夹心结合。将夹心复合物上的条形码DNA通过加热解离下来作为检测信号,进行PCR检测及4%琼脂糖凝胶电泳分析,同时采用SYBR Green荧光定量PCR法对p24抗原的含量进行鉴定,最后与ELISA法灵敏度及线性检测范围进行比较。研究结果1、筛选出抗HIV-1p24的单抗1G12和1D4,分别作为纳米生物条形码技术检测HIV-1p24抗原的捕获抗体和检测抗体；2、应用配对抗体构建夹心ELISA法检测HIV-1p24抗原,其最低检测限为1000pg/ml,线性检测范围为3000-100,000pg/ml;3、采用传统的磁珠式纳米生物条形码技术结合终端PCR凝胶电泳法检测HIV-1p24抗原,PCR产物电泳条带的强弱与所检测p24抗原含量具有良好的对应关系,PCR产物的DNA含量随着待测p24抗原浓度的降低而减少,最低检测限可达到O.1pg/ml,线性检测范围是0.1-1000pg/ml;4、采用新建的微孔板式纳米生物条形码技术结合终端PCR凝胶电泳法检测HIV-1p24抗原,最低检测限可达到1pg/ml,线性检测范围为1～10,000pg/ml。终端采用荧光定量PCR法进行鉴定时,检测CT值随着待检p24抗原含量的增加而逐渐降低,p24抗原浓度范围在0.1pg/ml～1000pg/ml时,CT值与之具有良好的线性关系；5、新建的微孔板式纳米生物条形码技术检测病毒培养上清中p24抗原含量,灵敏度为7.9pg/ml.检测7份HIV-1阴性血清,结果均为阴性。研究结论1、抗HIV-1p24单克隆抗体1G12和1D4可以用于纳米生物条形码方法检测HIV-1p24抗原；2、传统的磁珠式纳米生物条形码技术结合PCR凝胶电泳法可以对HIV-1p24抗原进行检测,灵敏度与ELISA法比较,可提高4个数量级,线性检测范围比ELISA法宽至少2个数量级；3、本研究所建立的微孔板式新型纳米生物条形码技术结合PCR凝胶电泳法检测HIV-1p24抗原具有更好的简便性和可操作性等优势,检测灵敏度与ELISA法比较,可提高3个数量级,线性检测范围比ELISA法宽至少2个数量级；4、应用微孔板式纳米生物条形码技术可以检测HIV-1病毒培养上清,具有良好的分析灵敏度和分析特异度。