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目的:本研究旨在探讨川崎病(KD)血清诱导对人冠状动脉内皮细胞(HCAECs)的损伤作用与可能机制,以及小檗碱(BBR)的保护作用与可能机制。方法:KD急性期患儿20例,正常同年龄范围对照组20例,KD患儿于入院治疗时直接取血备检。1、分别用健康儿童、KD患者血清标本孵育人冠状动脉内皮细胞并分组,用小檗碱(BBR)提取液分别加入两组细胞标本进行培养并分组;2、用流式细胞技术分别检测细胞周期(G0,G1,G2,S)比例、凋亡细胞比例;3、用Western blotting检测内皮细胞损伤标志物(THBD、VWF、EDNI)变化;4、用iTRAQ试剂标记及RPLC-MS分析法质谱检测每组中差异表达的蛋白质;5、用Cytoscape plug-in ClueGO和ReactomeFIViz软件检索差异表达蛋白的相关信息;6、用Western blotting验证KD组、健康儿童组血清培育HCAECs在BBR处理前后差异表达的蛋白质(ATF4、eIF-2α和p-eIF-2α;HSP90B1、DNAJC3、HSPG2、P4HB、VCP和HSPA5)。结果:1、流式细胞技术分析细胞凋亡结果示:加入BBR前,KD组凋亡细胞比例(67.6%)比对照组细胞比例明显上升(52.8%),提示KD可能诱导细胞凋亡;BBR处理后,BBR+KD组(67.6%KD,63.6%BBR+KD)比KD组有更少的细胞凋亡。2、流式细胞仪分析细胞周期结果示:加入BBR前,对照组中处于G0/G1期的细胞百分率比KD组上升(KD组:67.6%→对照组:74.1%),而G2期的细胞百分率下降(KD组:17.4%→对照组:16.9%),同时S期的细胞下降更明显(KD组:15.8%→9.5%),提示KD组血清可诱导细胞增殖;然而,加入BBR后,KD组中处于G0/G1期的细胞百分率比加入前上升(KD组:67.6%→BBR+KD组:80.2%),而G2期的细胞百分率下降(KD组:17.4%→BBR+KD组:13.2%),同时S期的细胞下降更明显(KD组:15.8%→7.0%)。3、使用western blot方式检测KD组在加入BBR前后血管内皮细胞损伤标记物(THBD、VWF、EDNI)的表达变化。结果表明,在加入BBR前,KD组的这三种标志物比对照组高表达(P﹤0.01),提示KD血清能诱导HCAEC细胞的损伤。然而,加入BBR后,KD组这三种标志物的表达比加入BBR前下降。4、用MS分析结合iTRAQ技术检测对照组、KD组、BBR+对照组、BBR+KD组中HCAEC的蛋白,结果提示KD组在加入BBR前后有蛋白差异表达。5、为了阐明这些差异表达蛋白之间的关系,采用了Cytoscape软件来构建交互网络。将BBR处理前后的KD组中差异表达的蛋白质根据其功能分成用不同颜色标记的六个不同的簇。结果显示,在BBR处理前,ER相关蛋白(HSP90B1、CALR、P4HB、HSPA5、VCP)和血管内皮细胞损伤相关蛋白(VWF和FGG)组成网络枢纽。而在BBR治疗后,VCP、CALR、VWF和FGG被排除在枢纽外。6、为了了解在KD条件下蛋白质水平和BBR处理的变化的生物学相关性,根据它们的生物学功能对鉴定的差异表达的蛋白质进行分类。结果显示,在KD组中包含五种生物过程,包括血液凝固,蛋白质活化级联,对ER应激的反应,三羧酸代谢过程和细胞外基质组织。然而,BBR处理后,仅剩下血液凝固,单一生物细胞粘附和过氧化氢分解代谢过程。此外,主要差异表达的蛋白质参与ERS,ERAD途径,从ER过程的逸出的蛋白质,血管大小的调节和血液凝固的负调节。7、为了证实BBR对KD血清诱导的ER应激的调节作用,我们首先检测了对照组和KD组HCAEC中ERS相关蛋白在加入BBR前后变化水平。结果显示KD血清诱导HCAEC中ERS相关蛋白的表达(P﹤0.01),BBR可以逆转KD诱导的增加的表达。结论:KD患儿血清可促进HCAECs细胞凋亡、引起HCAECs损伤,BBR能显著修复KD患儿血清诱导的HCAEC细胞的损伤。内质网应激(ERS)可能是BBR保护KD诱导的HCAECs损伤的机制之一。