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本研究对1株鹅副黏病毒分离株26/goose/guandong/98(简称26号分离株)和1株鹅细小病毒分离株goose/Fshan/2000(简称FSh分离株)进行外源病原检测、生物学特性的测定及主要基因的测序,并制备成二联灭活疫苗对鹅进行免疫保护试验,分析免疫抗体消长规律,为研制鹅副黏病毒和鹅细小病毒二联灭活疫苗奠定基础。
外源病原检测试验表明,两株毒株均不含禽流感H1、H5、H9亚型病毒、减蛋综合征病毒、传染性支气管炎病毒、禽白血病抗原、支原体和常见细菌。致病性试验表明,两株病毒均可以使20日龄非免疫鹅发病,毒力测定试验结果显示:26/goose/guangdon/98株的鸡胚半数感染量(EID50)为10培-8.5/0.2mL,鸡胚平均致死时间(MDT)为51h,脑内致病指数(ICPI)为1.675,静脉致病指数(IVPI)为2.45。鹅细小病毒株经番鸭胚增殖后,番鸭胚半数致死量ELD50为10-3.36/0.2mL。
鹅副黏病毒26/goose/guangdong/98株F基因测序及结果表明:F基因全长1662bp,编码553个氨基酸;根据F基因3端375bp核苷酸基因分型为基因Ⅶ型,是我国目前流行的基因型。F基因与NA-1株的相似性最高,为99.5％,与SF02株和ZJ1株的相似性分别为97.5％和97.4％,与Clone 30株的相似性仅为84.4％;核苷酸遗传进化分析表明:该毒株F基因与NA-1株F基因的亲缘关系最近,与Clone 30株的F基因亲缘关系最远。F蛋白氨基酸序列在其裂解位点附近的氨基酸组成具有APMV-1(NDV)强毒株的标志,即"112R-R-Q-K-R-F117",与毒力测定结果一致。HN基因的核苷酸相似性比较结果显示与NA-1株的相似性最高为99.4％,与SF02和ZJ1的相似性均为96.6％,与B1 takaaki和Clone 30的相似性最低,均为82.7％。HN基因遗传进化分析表明:该毒株与NA-1株的亲缘关系最近,与B1 takaaki和Clone 30株的亲缘关系最远,与F基因遗传进化分析结果一致。
鹅细小病毒分离株VP3基因测序及结果分析表明:GPV FSh株VP3基因全长1605bp,编码534个氨基酸,与国外发表的GPV B株VP3基因核苷酸序列相比较,相似性为96.5％,核苷酸的变异除个别突变点外,主要集中在两个区域,VP3基因5端321～417bp区和3端791～1276bp区。氨基酸序列与GPV B株的突变主要集中在266位和417位氨基酸之间,这一区域是VP3基因的高变区。VP3核苷酸遗传进化分析表明:MDPV与GPV明显分为两大分支,GPV与MDPV又分别分出两支,从进化树上看,国外分离株与国内分离株亲缘关系较远;分离株VP3基因核苷酸序列在797、1141、1144、1169、1185位为G、A、G、C和T,符合鹅细小病毒强毒株VP3共有的特征。
本研究将两株毒株的尿囊液分别用0.1％甲醛溶液灭活24h,灭活效果检验合格后制备成二联油乳剂灭活疫苗。抗体检测结果表示:试验鹅接种该疫苗后无不良反应,免疫后免疫保护抗体可以持续4个月,HI抗体效价最高可以达到7.5±0.22log2;中和抗体最高可以达到4.080±0.080log10,且HI抗体、中和抗体水平下降趋势较平缓。攻毒试验结果表明:不同免疫剂量对鹅的保护率在3/6～6/6之间,其中最小免疫剂量为0.3mL/只。二联灭活疫苗以0.5mL/只剂量二免后3周,免疫鹅均能获得良好的保护效果。