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茶树多酚氧化酶(PPO)是一类含铜氧化还原酶,是红茶加工中品质形成的关键酶。本研究克隆了茶树PPO基因家族,优化了PPO诱导表达条件,定量分析了茶树PPO基因家族在不同品种、不同季节中的表达,并分析了不同品种茶树单核苷酸多态性。主要研究结果如下:1、利用生物信息学方法分析PPO基因的核酸和氨基酸序列,预测了编码蛋白质的PPO基因的物理化学性质和结构功能。在PPO基因家族转录的氨基酸序列中相对分子量最小的是PPO2,为22.01KD,最大的是PPO1,为65.9KD;PPO1和PPO3编码蛋白定位于叶绿体中的可能性最大,预测这两个蛋白含有叶绿体转运肽;4个PPO基因编码的蛋白不存在信号肽,均为亲水性蛋白,属于非分泌蛋白,合成后不进入内质网和高尔基体分泌途径,直接释放于细胞质中。PPO2和PPO4编码的蛋白定位于非叶绿体和非线粒体的其他位置的可能性最大,PPO1和PPO3基因编码的蛋白可能存在一个或多个跨膜螺旋。2、根据公布的茶树基因组,应用PCR技术克隆PPO1和PPO3碱基序列,获得1800bp左右的特异性条带,将DH5α感受态细胞成功转入PPO重组质粒,经Bam HI、Not I两种限制性内切酶切开连接后导入感受态表达菌株Bl21中进行融合表达,经IPTG诱导后得到重组蛋白,其大小约为91kD。重组表达菌株在IPTG浓度为0.2mM,诱导温度为18℃,诱导时间为6H,诱导表达效果最佳。3、不同茶树品种PPO酶活性差异较大,政和大白茶、海南大叶、桃源大叶和汝城白毛茶的酶活性大于40 OD·g-1·min-1,适制红茶;平阳特早、安吉白茶、福选9号、菊花春和玉笋的酶活性低于5.0 OD·g-1·min-1,适制绿茶。槠叶齐、桃源大叶和碧香早3个湖南主栽品种酶活性的季节变化规律为:夏季>秋季>春季。4、PPO1基因的总体相对表达量范围为0.24～523.04,表达量最高品种为浙农139,最低为湄潭5号;PPO2基因的总体相对表达量范围为0.24～160.02,表达量最高品种为浙农139,最低为湄潭5号;PPO3基因表达在样品桃源大叶、六杯香、红芽佛手、紫鹃、福鼎大毫、浙农139和高桥早中表达量较高;PPO3基因的总体相对表达量相对表达量范围为0.13～17451.00,表达量最高品种为浙农139,最低为小叶福鼎;PPO4基因表达整体偏低,可能要受其他外源因素诱导才会表达。PPO1基因表达量与PPO2基因的表达量呈显著正相关(r=0.770,p<0.01),与PPO3基因的表达量呈显著正相关(r=0.809,p<0.01)。PPO2基因的表达量与PPO3基因表达量呈显著正相关(r=0.755,p<0.01)。PPO酶活性与PPO1、PPO2、PPO3、PPO4基因的表达量没有显著的相关性。5、对94个不同茶树品种进行PPO基因单核苷酸多态(SNP)分析。多酚氧化酶基因中外显子共有1 800个碱基,外显子存在92个SNPs位点,平均每20个碱基出现1个SNP位点,表明PPO基因在所选茶树品种之间的种群间遗传多样性较高。转换类型有A?G,C?T,颠换类型有A?C,A?T,G?C,其中62个SNPs属于同义突变,30个SNPs位点为非同义突变,导致氨基酸发生变异,占31.5%。利用不同茶树品种间的PPO基因SNP位点,可以成功鉴别区分开94个品种。高PPO酶活品种桃源大叶和海南大叶在第955位、678位和1522位发生突变。