目的:基于肠神经形态与功能异常的小鼠便秘动物模型,探究电针上巨虚和天枢调节肠运动的效应差异,并观察肠神经标志物及肠道内不同类型神经元的变化情况,分析电针对肠运动调节的局部肠神经机制,为针灸治疗相关疾病的提供科学基础。方法:第一部分:小鼠便秘模型制作的方法。采用3周龄雄性C57BL/6J小鼠,体重20-25g,随机分为3组,冷饮刺激A组,正常饲养B组和温饮刺激C组。所有实验动物随机分于单笼并标记号码,正常饲食、饮水。单笼盒内置铁丝网紧贴于垫料之上,用于隔离粪便易于收集。为了减少实验动物本身生物节律的干扰,在固定时间段即每日上午9:00开始干预刺激。A组给予0-4℃生理盐水,首次0.2 ml/只,为防止实验动物机体适应刺激,每5d后多0.05 ml/只,实验周期一共2周。B组,不给予灌胃,正常饲养。C组灌胃给予15-20℃生理盐水,其余同A组。停止灌胃后,各组继续正常饲养,观察6d,直至20d结束。实验周期内,观察粪便性状和重量改变,以及肠动力的变化。第二部分:基于上述便秘模型,筛选出便秘的小鼠。在观察首粒排便时间中,便秘小鼠随机分为三组,即模型组、上巨虚组和天枢组,相同数量的正常小鼠,设为正常组。电针参数为2/15 Hz,lmA,实验针刺时间为15 min/d,共3d。重复制作模型方法,在记录肠内压电生理实验中,选取便秘小鼠和正常小鼠,将自制水囊测压头放置于小鼠近端结肠或远端结直肠,经压力换能器转化后测定近端结肠或远端直结肠的肠内压,在波形出现后待其持续且稳定,先保存一段为基线参考数值,再随机顺序进行电针刺激,干预完成后待基线重新稳定方可进行下一个穴位的针刺,电针参数同上,时间为1 min。通过不同实验,分析上巨虚和天枢对便秘模型产生的效应差异以及差异部位。第三部分:不同批次重复制作模型及分组过程,便秘小鼠随机分为三组,即模型组、上巨虚组和天枢组,相同数量的正常小鼠,设为正常组。给予上述电针参数干预3d后,禁食12h取下近端结肠组织。通过免疫组化(immunohistochemistry)、实时荧光定量核酸扩增检测(real-time quantitative polymerase chain reaction,qPCR)和免疫印迹(Western Blot,WB)检测肠神经标志物PGP 9.5和胆碱能神经元标志物ChAT、氮能神经元标志物nNOS表达水平的变化,分析上巨虚和天枢产生效应差异的肠神经机制。结果:第一部分:在持续给予冷饮刺激14d后,小鼠出现不同的机体状态,其中状态Ⅲ表现出便秘症状且在停止干预后稳定存在6d以上。在持续干预过程中,可依据9-14d粪便重量及粪便性状的变化,筛选出状态Ⅲ小鼠即便秘动物模型。第二部分:上巨虚和天枢,对小鼠便秘状态都有治疗作用,缓解便秘症状,但二者效应并不完全一致,在首粒排出指示剂实验中,上巨虚恢复排便时间至正常水平,天枢虽有作用但未能恢复至正常。在粪便重量和性状方面,虽无明显统计学差异,但天枢组小鼠粪便平均重量仍低于正常小鼠和上巨虚组小鼠。此外,在肠内压实验中,在远端结直肠部位,上巨虚和天枢均能提高肠内压(促进肠运动),在近端结肠部位,上巨虚仍能提高肠内压(促进肠运动),而天枢无效应。第三部分:免疫组化结果表明上巨虚对便秘小鼠近端结肠ENS有调节作用,而天枢无明显作用。此外,qPCR和Western Blot结果显示上巨虚可以下调高表达的氮能神经元标志物nNOS至正常水平,同时上调低表达的胆碱能神经元标志物ChAT至正常水平,而天枢只能下调高表达的氮能神经元标志物nNOS至正常水平。结论:1通过冷饮刺激,可以在不依赖药物的状态下诱导小鼠出现便秘症状,且可稳定持续一段时间,持续的冷饮刺激会引起肠神经形态和功能出现异常。2上巨虚和天枢都可以缓解便秘症状,但二者在改变便秘小鼠的粪便重量、粪便性状和肠道功能上效应并不完全一致。在便秘小鼠的远端结直肠部位,二者均具有促进作用,而在便秘小鼠的近端结肠部位,上巨虚具有促进作用,天枢无明显作用。3在便秘小鼠近端结肠,上巨虚对ENS有调节作用,而天枢无明显作用。上巨虚和天枢通过影响ENS中不同类型的神经元产生效应差异。