EB病毒LMP1相关miRNA-mRNA网络分析及miRNA-134在EB病毒相关胃癌细胞系中作用初探

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目的:EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)潜伏膜蛋白1(Latent membrane protein1,LMP1)在多种EBV相关肿瘤发生发展中起重要作用。微小RNA(microRNA,miRNA)表达水平改变是LMP1广泛效应中的重要方面,这些microRNA(miRNA)进一步通过多种机制影响基因转录本的表达水平,影响疾病进程。在整体水平上LMP1引起的mRNA和miRNA的改变尚缺乏研究,探索LMP1相关miRNA-mRNA的相互作用关系对于阐明EBV参与肿瘤发病机制具有重要意义。本研究利用整合组学的理念,筛选LMP1相关的功能性miRNA和mRNA,应用生物信息学方法对现有公共数据进行深入挖掘,并通过它们之间的调控关系进行预测分析和数据整合,构建LMP1相关miRNA-mRNA调控网络,从中寻找发挥关键作用的因子,为EBV相关疾病发病机制研究提供新的思路。  EBV感染上皮细胞可导致细胞内外环境产生显著变化,其中miRNA表达水平的变化可能与肿瘤相关基因的表达水平改变相关,在EBV相关肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用。miRNA-134已被证实与多种肿瘤发生相关,其可作为抑癌基因也可作为癌基因参与不同类型肿瘤过程。本研究第一部分通过对基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus,GEO)分析,在GSE26596数据集中,miR-134可能参与EBV相关上皮性肿瘤发展,故进一步选择EBV阴性和阳性胃癌细胞系进行初步探究,为进一步明确miRNA-134参与上皮肿瘤的作用机制提供依据  方法:从GEO下载两组LMP1相关数据集GSE29297和GSE26596,利用基因大数据实验室(Gene-Cloud of Biotechnology Information,GCBI)构建LMP1相关基因的相互作用网络,分析LMP1相关基因表达趋势并构建趋势模型。利用GEO工具GEO2R分析LMP1相关的差异miRNA,结合多个miRNA数据库与前述基因模型联合分析,构建miRNA-mRNA互作网络。  qRT-PCR方法检测EBV阳性和阴性胃癌细胞系中miR-134-5p的表达水平。分别将人工合成的hsa-miR-134-5p模拟物、抑制物以及各自相应对照物瞬时转染至EBV阳性细胞系GT39和EBV阴性细胞系SGC-7901,qRT-PCR检测转染细胞中miR-134-5p的表达水平。采用CCK-8法检测各组细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞凋亡情况,细胞划痕检测细胞迁移情况。  结果:①分析GSE29297数据集获得2802个LMP1相关趋势基因,分析GSE26596数据集获得102个上调miRNA和6个下调miRNA。②利用GCBI平台对GSE29297数据集进行分析,依据5个时间点建立了20个表达模型,其中15个具有统计学意义。其中具有表达上升趋势的模型包括1070个差异基因,具有下调趋势的模型包括1422个差异基因。③对差异基因进行分析,构建了由245个基因组成的661个连接的基因共表达网络。④利用整合的miRNA数据库miRWalk2.0分析差异miRNA的靶基因,并与上下调趋势模型联合分析构建了相互作用网络图。⑤miR-134-5p在3种EBV阳性细胞系GT38、GT39和SNU-719的表达水平显著高于EBV阴性细胞系SGC-7901、MKN-45和HGC-27中的表达水平(t=6.023,P<0.001)。⑥模拟物转染SGC-7901后的miR-134-5p表达水平显著升高(t=13.747,P<0.001),而抑制物转染GT39细胞系后未检测到miR-134-5p明显降低(t=-2.229,P>0.05)。⑦SGC-7901细胞转染miR-134-5p模拟物后CCK-8吸光度值明显低于模拟物对照(各时间点P<0.001),细胞存活能力减弱;细胞凋亡水平高于模拟物对照(t=7.793,P<0.001);细胞迁移速率与模拟物对照比较无明显差异(t=1.107,P>0.05);EBV阳性细胞系GT39转染miR-134-5p抑制物后增殖能力较对照细胞增强(各时间点P<0.01),迁移速率较对照加快(t=5.403,P<0.001),而凋亡水平低于对照细胞(t=-7.393,P<0.01)。  结论:本文通过对公共数据的挖掘,整合分析获得了LMP1相关的差异表达mRNA,并建立了基因表达模型,同时构建了基因共表达网络和通路相关网络以及miRNA-mRNA相互作用网络,为LMP1相关的miRNA在肿瘤的研究提供了新的思路。抑制EBVaGC细胞系GT39中miR-134-5p表达,细胞增殖和迁移能力增强,细胞凋亡减弱;转染miR-134-5p模拟物可抑制EBVnGC细胞系SGC-7901增殖,促进其凋亡,对迁移能力无明显影响;提示miR-134-5p可能作为抑癌因子在EBVaGC发生发展中发挥一定作用。
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