异丙酚(propofol),又名丙泊酚,化学名称为2,6-双异丙基酚(2,6-di-isopropyl phenol),是一种快效、短效静脉麻醉药。由于其具有舒醒迅速而完全,持续输注后无蓄积等特点,因此目前普遍应用于麻醉诱导、麻醉维持,也常用于麻醉中、手术后与ICU病房的镇静。除了常规的催眠、镇静与遗忘作用外,目前认为异丙酚还具有降低动脉血压,降低氧化应激损伤以及抑制炎症反应等的功能,具体表现为:抗氧化,减轻细胞内钙离子超载,抑制细胞凋亡,减轻白细胞和内皮细胞粘附、抑制中性粒细胞呼吸爆发,调节炎性细胞因子的平衡,改善缺血心肌细胞再灌注后高能磷酸盐合成,改善低灌流状态下肝细胞对氧的再摄取,抑制高血糖症大鼠脑组织再灌注后乳酸堆积及组织水肿,直接改善细胞能量代谢障碍等。在这些效应中,起关键作用的就是异丙酚的抗氧化效应。　　 氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时,体内高活性分子如活性氧自由基(reactiveoxygenspecies,ROS)和活性氮自由基(reactivenitrogenspecies,RNS)产生过多,氧化程度超出氧化物的清除,氧化系统和抗氧化系统失衡,导致中性粒细胞炎性浸润,蛋白酶分泌增加,产生大量氧化中间产物,从而导致细胞损伤。ROS包括超氧阴离子(.O2-)、羟自由基(.OH)和过氧化氢(H2O2)等；RNS包括一氧化氮(NO)、二氧化氮(NO2)和过氧化亚硝酸盐(.ONOO-)等。其中一氧化氮(NO)是L-精氨酸(L—Arg)在一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)催化下生成的一种气体自由基。在应激和炎症等病理条件下,NO与O2-结合形成过氧化亚硝酸盐(ONOO-)。ONOO-是一种很强的嗜核RNOS,它可以使蛋白的酪氨酸残基亚硝基化,这样便可以通过抑制酪氨酸磷酸化来调节蛋白的功能,还可导致DNA损伤、脂质过氧化、蛋白降解、蛋白半胱氨酸残基发生S-亚硝酰化等,最终可致细胞损伤或死亡。NOS有三种亚型,即神经型(neuronal NOS,nNOS)、内皮型(endothelial NOS,eNOS)和诱生型(iducible NOS,iNOS)三种NOS。其中,nNOS和eNOS又称为结构性NOS(cNOS)。cNOS主要调节血管内皮细胞产生少量NO,其生理功能是通过控制血管舒张来维持血压和局部血液循环。iNOS又称为诱生型NOS,即一般认为在静止的细胞中不存在或含量非常低,但可为多种不同刺激所诱导,这些刺激包括LPS、TNF-α、IL-1β、IFN-γ以及缺氧等。氧化应激时,主要表现为iNOS升高,诱导细胞产生大量NO,形成过量的过氧化亚硝酸盐进一步导致细胞损伤。最近研究表明,iNOS的表达受p38 MAPK的调控。　　 p38 MAPK于1993年被Han等发现,由360个氨基酸组成,分子量约38kD,属应激激活的蛋白激酶。目前已发现p38 MAPK家族成员有p38α、p38β、p38γ、p38δ。鉴于p38α,p38β都有各自的剪切亚型,因而共有6个p38 MAPK亚型；各个亚型之间的不同功能可能与其在不同组织的表达,激活方式以及底物特异性相关,不同的p38能被细胞应激(紫外线辐射、渗透性休克、热休克、脂多糖、蛋白合成抑制剂)、细胞因子如白细胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,YNF-α)等激活。研究表明,激活P38 MAPK可以诱导iNOS表达增加。最近研究发现,抑制P38 MAPK.可以抑制LPS介导的巨噬细胞iNOS表达。　　 氧化应激活性中间产物,如过氧化氢、过氧化亚硝基阴离子、脂质过氧化产物丙二醛和四羟基壬烯醛等,既是细胞信号调节分子,又是细胞毒性效应子。它们能攻击体内的生物大分子,导致DNA、蛋白质或脂质的损伤,进而导致细胞死亡。研究表明氧化应激导致的细胞死亡与死亡结构域相关蛋白(Fas deathdomain-associated protein,Daxx)密切相关。当细胞受到一定程度的氧化应激刺激时,平时定位于细胞核中的Daxx蛋白,就会从细胞核移位到细胞浆,进而激活定位于细胞浆内的凋亡信号调节激酶-1(apoptosis signal-regulating kinase1,ASK1),并最终导致细胞死亡。ASK1是细胞丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAP3Ks)家族成员之一。多种应激损伤和促炎因子(如H2O2、TNF-α、缺血再灌注和化疗药物等)都可以激活ASK1,活化的ASK1又依次激活MKK4/MKK7-JNK和MKK3/MKK6-p38激酶途径,对应激做出应答或促使细胞凋亡。　　 首先我们以脐静脉内皮细胞为研究对象,研究第三丁基过氧化氢(t-BHP)刺激时,异丙酚抑制脐静脉内皮细胞NO产生的机制。我们分离培养并鉴定了脐静脉内皮细胞,通过Western blot检测异丙酚对t-BHP刺激下p38MAPK磷酸化的影响,并用RT-PCR检测iNOS和eNOS的表达。接着我们以人HEK293细胞作为研究对象,研究H2O2刺激时,异丙酚对HEK293细胞的保护作用,然后采用免疫荧光、核质分离以及Western blot等实验技术研究在H2O2刺激下,异丙酚对Daxx-ASK1信号通路的影响。所有数据分析均采用SPSS13.0处理,所有计量资料用均数±标准差((x)±s)表示。两组间均数比较采用独立样本t检验,方差齐性用Levene检验。MTT的结果相同剂量不同处理的两组之间采用studentt-test进行分析。Western-blot灰度值、RT-PCR荧光值在One-Way ANOVA多重比较中,方差齐性采用LSD法,方差不齐时采用Dunnett’T3法检验。取α=0.05为检验标准。　　 结果表明,各组之间p38 MAPK磷酸化有显著差异(F=154.311,p<0.001),与对照组相比,t-BHP处理后能显著诱导脐静脉内皮细胞中p38 MAPK磷酸化(p<0.001),而与t-BHP组相比异丙酚预处理后可以抑制t-BHP诱导的p38 MAPK磷酸化(p<0.001)。其次,各组之间iNOS、eNOS有显著差异(F=934.786,p<0.001；F=664.946,p<0.001),t-BHP组iNOS和eNOS表达增加(与对照组相比,iNOS:p=0.001,eNOS:p<0.001),而异丙酚预处理后可明显抑制其表达(与t-BHP组相比,iNOS:p=0.001,eNOS:p<0.001),更重要的是p38 MAPK抑制剂SB203580也可以抑制iNOS和eNOS表达(与t-BHP组相比,iNOS:p=0.001,eNOS:p<0.001)。这表明t-BHP通过诱导p38 MAPK磷酸化,增加iNOS和eNOS的表达,从而产生氧化损伤。而异丙酚能抑制t-BHP诱导的p38MAPK磷酸化,抑制iNOS和eNOS的表达,在脐静脉内皮氧化应激中发挥保护作用。这些结果提示:提示异丙酚通过抑制p38 MAPK的磷酸化,减少iNOS、eNOS表达,减轻氧化应激从而起到保护脐静脉内皮细胞的作用,从一个方面揭示了,氧化应激时异丙酚的保护机制。我们采用MTT实验验证了在200-500μmol/L浓度H2O2刺激下,异丙酚100μM预处理对HEK293细胞具有一定的抗氧化保护作用(与200-500μmol/L,H2O2刺激组相比,异丙酚预处理+200-500μmol/L H2O2刺激组t,p分别为t=-4.420,p=0.001；t=-7.538 p<0.001；t=9.173 p<0.001；t=0.403,p<0.001)。进而我们采用保护效应明显的300μmol/L浓度的H2O2刺激下,通过免疫荧光以及Western blot我们都证实,异丙酚能够一定程度上抑制由氧化应激刺激所诱导的Daxx蛋白出核(与H2O2刺激组相比,免疫荧光:p=0.042,Western blot:p=0.001),以及ASK1的激活(与H2O2刺激组相比,Western blot:p=0.001)。相比于正常对照组,H2O2刺激时异丙酚处理组仍然有一定程度的Daxx出核以及ASK1的激活。这也与MTT实验结果相吻合,说明异丙酚只能部分缓解氧自由基对细胞所造成的损伤。而在氧化应激时,异丙酚之所以能够抑制Daxx蛋白的出核,我们推测这可能与其具有明确的抗氧化作用有关。在化学结构上异丙酚与维生素E,丁化羟基甲苯等抗氧化剂十分相似,均具有一种酚羟基结构,可直接与氧自由基反应形成稳定的2-6-二异丙酚基苯氧集团而清除氧自由基。Kokita等人发现临床麻醉浓度异丙酚即可减轻过氧化氢引起的脂质过氧化,微量血浆浓度异丙酚就可以保护细胞膜,而且在与血浆蛋白结合的状态下仍能发挥其抗氧化作用。另外,异丙酚具有良好的脂溶性,能积聚在细胞膜的脂质双分子膜上,提高细胞抗氧化损伤的能力。由此可见异丙酚在对抗氧自由基损伤,保护细胞方面具有重要功能。最新研究发现异丙酚可抑制氧化应激引起的caspase-3活性的增加,降低内皮细胞的损伤和凋亡；通过激活细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulatedkinases1/2,ERK1/2)信号通路抑制促凋亡蛋白Bad(Bcl-X1/Bcl-2 associated deathpromoter)和Bax(Bcl-2-associated X Protein)的表达,相对增加抗凋亡蛋白的浓度,进而抑制细胞的凋亡作用。鉴于以上结果我们由此推测,异丙酚正是通过这些综合作用减弱了氧自由基对细胞的损伤,进而使Daxx蛋白的出核减少,ASK1激活程度降低。　　 综上所述,我们的研究发现异丙酚通过抑制p38 MAPK的磷酸化,减少iNOS、eNOS表达,抑制Daxx蛋白出核及ASK1的激活,减轻氧化应激对细胞的损伤,进一步阐明了氧化应激时异丙酚的保护机制。