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研究目的肿瘤微环境与肿瘤转移密切相关。癌相关成纤维细胞(Cancer-associated fibroblasts,CAFs)是肿瘤微环境中最主要的间质细胞成分之一,本课题组前期研究发现,胃癌CAFs中microRNA-214(miR-214)表达显著下调,对CAFs促进胃癌细胞迁移和侵袭的能力至关重要,但具体作用机制尚不清楚。本研究将探讨CAFs来源的miR-214对胃癌侵袭转移作用的内在分子机制,为胃癌的临床治疗提供新的靶标和思路。研究方法1.原代培养人胃癌CAFs,通过转染miR-214 mimic上调其miR-214表达,用条件上清液(conditioned medium,CM)培养胃癌细胞,CCK8、Edu、流式细胞术检测癌细胞增殖和凋亡能力变化;免疫荧光、Western Blot方法检测癌细胞EMT(epithelial-to-mesenchymal transition)相关蛋白表达,探讨CAFs来源的miR-214是否通过激活EMT促进癌细胞迁移和侵袭。2.Real-time PCR、Western Blot方法检测miR-214上调后CAFs中FGF9(fibroblast growth factor 9)mRNA及蛋白表达变化;双荧光素酶报告基因方法验证FGF9是miR-214的靶基因;向CAFs-CM中加入FGF9中和抗体,观察癌细胞迁移和侵袭能力变化。3.在人胃癌石蜡标本中,原位杂交检测miR-214的表达,分析与预后的关系;免疫组化检测FGF9蛋白表达,分析FGF9的表达与临床病理特征及预后的关系。研究结果1.上调CAFs中miR-214表达显著增加胃癌细胞E-cadherin表达,减少Vimentin、N-cadherin和Snail表达,提示miR-214抑制胃癌细胞EMT;miR-214对胃癌细胞增殖和凋亡能力没有明显影响。2.上调CAFs中miR-214表达后,CAFs中FGF9 mRNA及蛋白表达均减少;miR-214与FGF9基因3’UTR区域直接配对结合;用CAFs-CM培养胃癌细胞,向其中加入FGF9中和抗体,癌细胞的迁移和侵袭能力被抑制。3.MiR-214在人胃癌组织CAFs和正常胃粘膜组织NFs中均未检测到,在癌细胞和正常胃粘膜上皮细胞中表达;癌细胞中miR-214表达显著低于正常胃粘膜,但并未提示预后;人胃癌组织中,FGF9主要表达在CAFs;淋巴结转移灶CAFs FGF9表达与肿瘤分化程度、Lauren分型及预后相关。研究结论1.上调CAFs中miR-214表达能够抑制胃癌细胞EMT,但对胃癌细胞增殖和凋亡无明显影响。2.FGF9是CAFs中miR-214发挥作用的靶基因,FGF9促进胃癌细胞的迁移和侵袭。3.FGF9在胃癌组织CAFs中高表达,淋巴结转移灶CAFs FGF9的高表达与肿瘤分化程度、Lauren分型及预后相关。