目的：　　 阿尔茨海默病(Alzheimers disease,AD)亦称老年性痴呆(senile dementia),是一种发生于中老年的以进行性认知障碍和记忆能力下降为主的退行性神经病变。该病起病隐袭,病程呈进行性进展,以渐进性学习记忆、认知功能减退、行为异常、日常生活能力下降及情感、思维障碍等为主要临床表现。其典型的病理改变是神经细胞间出现大量以β-淀粉样肽(β-Amyloid,Ap)为核心的老年斑(senile plaques,SP)、神经元的胞体中出现神经原纤维缠结(naeurofibrillary tangles,NFT)及神经元的丢失等。AD的发病机制目前尚未完全阐明,但自由基损伤学说和细胞凋亡学说备受关注。自由基形成和氧化应激增强,进一步引起神经细胞凋亡,是导致AD的功能退化和神经变性的基础。p75神经营养因子受体(P75 neurotrophin receptor,P75NTR)是神经营养素的低亲和力受体,与AD神经元细胞凋亡有关。P75NTR诱导凋亡的信号通路目前仍不十分清楚,但已被广泛公认的是其对c-jun氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase,JNK)的激活是介导神经元细胞凋亡的关键步骤,然后进一步通过激活促凋亡蛋白P53、Bad等的表达,促进或引起细胞凋亡。此外,JNK还能通过诱导细胞色素C的释放进一步活化Caspase-3而导致细胞凋亡。JNK(c-Jun N-terminal kinase,又称应激活化蛋白激酶,SAPK)基因由JNK1、JNK2和JNK3三条基因编码,每条基因都表达出46kD及54kD蛋白,通过选择性剪切产生十余个异构体。JNK1和JNK2在组织中广泛表达,而JNK3则局限于脑、心脏等组织中表达。JNK信号通路属丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路,多种刺激通过激酶级联反应激活MAPKKK(包括MLK,K、ASK、MEKK、TAK1等)然后激活MAPKK(MKK4/7),最终激活JNK。　　 JNK通路是真核生物细胞重要的信号转导通路,参与细胞增殖、发育、凋亡及多种生理和病理过程。JNK是一种特异性磷酸化核内转录因子 c-jun的激酶,通过使c-jun第63、73位丝氨酸双磷酸化,提高其转录活性JNK/c-Jun通路在多种神经元凋亡模型中激活,阻断JNK/c-Jun通路活性可以保护神经元免于凋亡。研究显示JNK/c-Jun通路为神经元凋亡所必需。直接阻断转录因子c-Jun的活性可以很好的保护神经元,提示c-Jun触发一些靶基因的表达进而介导凋亡。大量研究表明,神经元凋亡过程中JNK的激活并发挥重要作用。研究证明JNK的活化是神经元凋亡必需的。JNK存在多个底物,包括c-Jun,JunB、JunD、ATF2、Elk1、p53及NFAT等,从而介导不同的生物学过程,在神经元凋亡过程中,JNK主要通过c-Jun传导促凋亡信号。活化的JNK通过和转录因子c-Jun的氨基末端区域结合,使转录因子的活性区域发生磷酸化,从而使c-Jun转录活性提高。激活的c-Jun在结合到其下游靶基因启动子上的c-Jun DNA结合,进而触发基因的转录表达。研究表明,c-Jun的转录活性对神经元凋亡是必需的。c-Jun基因突变小鼠的神经元对凋亡刺激反应障碍,显微注射特异性c-Jun抗体干扰其功能,或采用去除转录激活区保留DNA结合区的负显性c-Jun突变体阻断c-Jun的转录活性,均可有效地干预了神经元凋亡的发生。这此研究显示神经元凋亡时转录激活的c-Jun触发了一些基因表达,而这些基因的表达对神经元凋亡的发生起了关键作用。　　 环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB)是多种信号转导通路的关键调节子,也是细胞内一个重要的信号分子,活化形式的CREB调节多种基因的表达。CREB是一种真核生物细胞核内的蛋白质,它的功能是调节基因的转录。通过Camp介导的信号转导系统,Camp与蛋白激酶A结合,进入细胞核内使CREB磷酸化,磷酸化的CREB可激活CREB调控的基因,表达产生长时记忆所需的蛋白质,在长时记忆中起重要作用。CREB在神经保护方面的作用及参与的信号转导机制己成为近年来神经科学领域研究的热点。　　 研究并建立可靠的AD动物模型对于探明AD的病因、发病机制及防治药物的研发均有重要的意义。目前用于AD研究的动物模型类型多样,其中转基因模型是一种病因模型,是一种过量表达人源性突变AD相关基因的转基因鼠,因其具有明确的病因,并能反映AD的部分病理与功能变化,有助于我们了解AD的发病机制,也逐渐成为研究AD的最为理想的整体模型。其中近年来研究的携带有瑞典突变的APP过表达及PS1外显子9缺失的转基因小鼠(APPswe/PS1dE9,APP/PS1)的出现为AD的进一步研究提供了更好的条件,该小鼠由Jackson实验室成功研究,品系名为B6C3-Tg(APPswe,PSEN1dE9)85Dbo/J,该小鼠是在鼠的蛋白酶因子启动子元件的控制下,直接的将表达有一个嵌合的小鼠/人含有K595N/M596L瑞典突变的APP基因和一个携带有外显子9缺失突变的人类PS1基因共转入小鼠基因组中,使其主要表达在中枢神经系统的神经元。APP/PS1小鼠在5个月时脑部即出现Aβ表达及少量的Aβ沉积,呈现出早期AD的病理改变,到9个月时,可见更多的Aβ表达及大量的Aβ沉积,呈现明显的AD的病理改变[27]。Lalonde等通过迷宫等行为学检测发现该小鼠在7月龄时即出现明显的学习记忆障碍,可部分的反映了AD的行为异常。因此该转基因小鼠模型成为重要的用于AD发病及治疗研究的动物模型。　　 防治AD的抗氧化剂及抗凋亡药物的研究与开发成为当今神经病学研究领域的重要课题之一。Humanin(HN)是2001年由Hashimoto等对阿尔茨海默病(AD)病人尸检后,在枕叶提取出的一种含有开放读码框(ORF)的cDNA文库,他们对这种cDNA文库的表达进行了功能监测,进而发现了一种编码为24个氨基酸的多肽,称之为Humanin。HN是1条由24个氨基酸残基组成的线性多肽,分子量为2656.13。其一级结构为:et-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Ser-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala。HN序列中包括三个部分,即以疏水的核心区GFSCLLLLTSEIDL为中心,两侧分别是极性的羧基端PVKRRA和氨基端MAPR。其中Pro3～Pro19为其功能核心区,其编码的氨基酸具有两大功能:分泌功能和神经保护功能。其核心区的Pro3、Ser7、Cys8、Leu9、Leu12、Thr13、Ser14和Pro19位点与HN的神经保护作用密切相关,全长HN中任何一个位点被Ala取代后将不再保护神经元免于Aβ诱发的神经毒性作用。HN第8位的半胱氨酸残基被丙氨酸残基取代后,HN失去活性,第14位的丝氨酸被甘氨酸残基取代后,即[Gly-14]-humanin(Met-Ala-Pro-Arg-Gly-Phe-Ser-Cys-Leu-Leu-Leu-Leu-Thr-Gly-Glu-Ile-Asp-Leu-Pro-Val-Lys-Arg-Arg-Ala,其分子量为2657.2,其神经保护作用是HN的1000倍。如果将Leu9替换成为精氨酸(L9R)则形成HNR,将没有神经保护的作用。最近的研究表明AGA-(C8R)-HNG17,HN17位变换氨基酸的衍生物,神经保护作用比HN强十万倍。HN的来源,Hashimoto等对阿尔茨海默病(AD)病人尸检后,在枕叶中提取出了HN,而后TAJIMA等用抗HN抗体(p04)与HN免疫反应法分析发现HN免疫反应活性可在AD患者的枕叶中被检测到,而AD患者的其它脑叶以及作为对照的者正常人脑中则检测不到。对动物体内是否存在与人类相同或者类似的神经保护肽的研究表明,研究者已在大鼠、小鼠、猴子、线虫等动物体内发现了HN的类似物。HN的作用方式是,Humanin是一种分泌型多肽,且分泌特性由其一级结构决定。它的Leu9-Leu12可形成一个疏水核心,使Humanin具有信号肽的结构特征。因此,当它与其它蛋白融合后即可发挥信号肽作用--启动分泌过程。Yamagishi在探讨Humanin的氨基酸组成与其分泌过程之间关系的研究中发现,当Leu9、Leu10、Leu11、Pro19和Va120分别被Arg取代后,Humanin的释放被阻断,表明Leu9-Leu11(正好邻近起关键作用的Cys8)和Pro192Va120两个结构域与Humanin的释放关系密切。另外,Ser7和Leu9两个位点对Humanin形成自身二聚体非常重要。在用Ala分别取代全长Humanin中任何一点氨基酸的研究中发现,只有当Ser7或Leu9被取代时,不出现Humanin二聚体,表明这两个位点与Humanin形成自身二聚体密切相关。Humanin需分泌至胞外发挥作用,Humanin是一种分泌性多肽,当胞内Ca离子及Camp升高时其分泌量增加,而内质网-高尔基体转运抑制剂BrefedinA则可阻断其分泌,表明Humanin的分泌过程受到细胞内分泌机制的调控。实验证明,Humanin被分泌至细胞外是其发挥作用的前提,其次是线性的Humanin必须形成二聚体,才能发挥生物学功能。　　 因此,本研究拟通过遗传性的APP/PS1转基因小鼠,采用Niss1、TVNEL染色、免疫组化、Western blot等方法研究APP/PS1转基因小鼠认知行为、病理改变、抗氧化能力、细胞凋亡、Aβ(1-40)、淀粉样前体蛋白(Amyloid precursor Protein,APP)及P75-JNK-P53凋亡相关通路的影响,即9月龄的APP/PS1转基因小鼠上述指标的改变,同时进一步探讨HNG对APP/PS1转基因小鼠模型的神经保护作用及其可能的作用机制。　　 材料与方法：　　 实验过程:取C57小鼠13只及APP/PS1小鼠24只,C57小鼠为对照组(Control)、APP/PS1小鼠24只随机分为模型组(APP/PS1)和实验组(APP/PS1+50μg/kg HNG)。实验组APP/PS1转基因小鼠按50μg/kg的剂量腹腔注射HNG,每日一次,连续腹腔注射2周;对照组及模型组小鼠腹腔注射等量的生理盐水,每日一次,连续腹腔注射2周。最后一周对小鼠进行水迷宫、避暗及自主活动等行为学检测,其间继续给药。行为学结束后,快速取一部分小鼠脑组织放入液氮中冻存,分别进行SOD、GSH-Px、MDA含量的测定及。Western blot印迹分析caspase-3、P75、c-Jun、P53等蛋白表达水平的实验。另一部分小鼠进行灌流固定,取脑后分别行HE、Niss1、TUNEL染色及Aβ(1-40)、APP、CREB等指标的免疫组化检测分析。　　 实验结果：　　 1、HNG对APP/PS1转基因小鼠记忆及判断能力的影响　　 水迷宫、避暗等行为学结果显示APP/PS1转基因小鼠出现明显的学习记忆及判断能力的下降,但活动能力未受影响。HNG明显的改善了APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍,提高了小鼠的记忆与判断能力。　　 2、HMG对APP/PS1转基因小鼠脑组织病理改变的影响　　 HE染色及Niss1染色结果显示,APP/PS1转基因小鼠大脑神经元数量明显减少,细胞排列松散,细胞核固缩、染色质边集和核碎裂,尼氏体分界不清,排列紊乱、松散,细胞周围出现间隙,其中许多细胞胞体缩小、胞浆呈淡红色、胞核固缩,可见坏死的神经元;HNG明显的减轻了APP/PS1转基因小鼠脑内神经元损伤程度,细胞排列相对整齐,细胞形态规则,层次丰富,核仁清晰。　　 3、HNG对APP/PS1转基因小鼠脑内Aβ(1-40)蛋白表达的影响　　 Aβ(1-40)蛋白免疫组化染色结果显示:APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的Aβ(1-40)蛋白表达水平显著增高;HNG能明显抑制小鼠大脑皮层及海马区的Aβ(1-40)蛋白表达水平。　　 4、HNG对APP/PS1转基因小鼠海马区SOD、GSH-Px酶活性及MDA含量的影响　　 化学比色法测定结果显示APP/PS1转基因小鼠海马内SOD、GSH-Px活性明显降低,MDA含量明显升高;HNG能明显的提高小鼠海马内SOD、GSH-Px酶活性,并明显的降低MDA含量。　　 5、HNG对APP/PS1转基因小鼠脑区神经元细胞凋亡的影响　　 TUNEL法染色结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区可见有较多的凋亡细胞,且细胞凋亡指数与空白对照组比明显升高;HNG能明显的减少APP/PS1转基因小鼠大脑内神经元细胞的凋亡。　　 6、HNG对APP/PS1转基因小鼠脑内APP蛋白表达的影响　　 APP免疫组化染色分析结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平明显增高;HNG明显的抑制了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的APP蛋白表达水平的增高。　　 7、HNG对APP/PS1转基因小鼠脑内P75NTR、JNK及P53蛋白表达的影响　　 Western blot印迹分析结果显示APP/PS1转基因脑内海马内P75蛋白的表达水平增高,同时海马区JNK2及P53蛋白表达水平增加;HNG可明显的抑制p75ICD、JNK2及P53蛋白表达水平。　　 8、HNG对APP/PS1转基因小鼠脑内CREB蛋白表达的影响　　 CREB免疫组化染色分析结果显示APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的CREB蛋白表达水平明显降低;HNG明显的促进了APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马区的CREB蛋白表达水平。　　 结论：　　 1、HNG能够改善APP/PS1转基因小鼠的学习记忆障碍。　　 2、HNG能够提高APP/PS1转基因小鼠脑内的抗氧化酶活性,及降低MDA含量,发挥有效的抗氧化作用及增强记忆能力的作用。　　 3、HNG通过抑制APP/PS1转基因小鼠大脑皮层及海马内的APP及Aβ(1-40)蛋白水平,减少对神经元有害物质的生成,发挥对神经细胞的保护作用。　　 4、HNG通过抑制APP/PS1转基因小鼠脑内P75ICD、JNK及P53凋亡通路相关蛋白表达水平,进一步抑制caspase-3蛋白活性,发挥对神经细胞有效的抗凋亡作用。