羊传染性脓疱病毒(Contagious Ecthyma Virus,简称CEV)是痘病毒科、副痘病毒属的双股DNA病毒,主要危害3-6月龄羔羊,引起急性、高度接触性的传染病——羊传染性脓疱。该病毒通过直接接触传染,在感染动物的口腔、唇、舌、鼻孔周围、乳房等部位的黏膜与皮肤形成丘疹、脓疱、溃疡和疣状痂皮。该病常呈群发性流行,传染性强,发病率高,继发感染的死亡率可达50%。吉林省主要养羊地区均有该病发生。该病是人兽共患传染病,给养羊业带来了巨大的经济损失。对人类的健康也构成威胁。F1L基因(ORF059)长为1011bp,编码39kDa蛋白,位于病毒基因组物理图谱的中央,是一个完整的开放阅读框,高度保守。39kDa蛋白在病毒的成熟过程中起着重要的作用。本研究选择病毒F1L基因为研究对象,通过对羊传染性脓疱病毒分离株F1L基因进行克隆及同源性分析,了解与其他毒株间基因序列差异,并选择保守基因片段作为分子生物学诊断的目的基因,建立新的诊断方法。为有效预防和控制羊传染性脓疱病毒传播,及时的作出准确诊断,提供科学依据。本研究共分为以下五个部分：1.羊传染性脓疱病毒的分离与鉴定：从吉林省松原市某一发病的羔羊群中,采取羊嘴唇等部位病变组织,处理后感染实验室自制的新生犊牛肾原代细胞,经细胞连续传代,细胞出现稳定病变。对该病毒进行了TCID50测定、病毒核酸类型鉴定试验、理化培养特性研究、电镜观察、动物回归试验及PCR检测,鉴定该株病毒为羊传染性脓疱病毒,命名为JLSY’株。2.羊传染性脓疱病毒吉林分离株F1L基因的克隆与同源性分析：常规方法制备新生犊牛肾原代细胞,接种本实验室自行分离的羊传染性脓疱病毒JLSY株,观察细胞病变,证明细胞感染病毒,收集病毒液。通过参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列设计引物,应用PCR技术扩增出羊传染性脓疱病毒JLSY株的F1L基因片段,与pMD18-T载体连接,转化至E.coli JM109中,阳性质粒通过PCR扩增和酶切鉴定后,选择2株含阳性质粒菌进行基因测序,并将F1L基因序列与几个国内外参考毒株的序列进行同源性比较和分析。结果显示,羊传染性脓疱病毒JLSY株与OV/Torino株同源性最低达97.6%,与Jilin株同源性最高达98.8%。说明羊传染性脓疱病毒JLSY株F1L基因与国内其他参考毒株之间差异不大,是病毒的保守的基因,可以选择该保守基因片段作为分子生物学诊断的目的基因。3.羊传染性脓疱病毒JLSY株F1L基因原核表达及蛋白纯化：设计含有特定酶切位点的引物,扩增出的F1L基因,用EcoR I和Xho I双酶切回收的PCR产物和pET28a载体,分别回收目的片段和载体片段进行连接,构建质粒pET28a-F1L、pET28a-F1L2,然后转化TOP10感受态细胞。提取测序正确的阳性克隆质粒,并转化入BL21表达菌株中。接种于LB培养液中培养,加入IPTG以诱导蛋白表达。表达产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测,出现预期目的蛋白条带,可溶性F1L蛋白经亲和层析纯化,进行浓缩,蛋白浓度为0.6mg/mL。4.羊传染性脓疱病毒环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及初步应用：参照GenBank中羊传染性脓疱病毒基因序列,针对病毒F1L基因保守区域设计扩增引物,通过对实验条件的优化,建立了基于LAMP技术的CEV快速检测方法,进行了该方法敏感性、特异性、重复性试验,采集临床样品进行初步应用。结果显示,阳性样品扩增产物在琼脂糖凝胶电泳检测中呈特征性梯状条带,阳性反应管加入荧光染料后变成绿色；对CEV的最低检出量为102拷贝／反应,比常规PCR方法高100倍；本方法检测山羊痘病毒、鸡痘病毒、口蹄疫病毒O型、口蹄疫病毒亚洲Ⅰ型病毒为阴性；相同样品进行10次检测,所得检测结果一致。由此说明,本研究建立的CEV LAMP检测方法敏感性高、特异性强、稳定性好。在LAMP反应体系中,加入1μL10×SYBR Green I,可进行实时荧光LAMP检测和定量实验。对30份临床样品进行检测,LAMP检测方法与常规PCR方法检测结果一致。本研究建立的LAMP检测方法,为CEV的快速检测和羊传染性脓疱病的临床诊断提供了一种方便快捷的方法。5.羊传染性脓疱病毒变性高效液相色谱检测方法的建立及初步应用：将PCR技术和变性高效液相色谱技术(DHPLC)相结合,参考GenBank中羊传染性脓疱病毒的F1L基因序列,应用Primer Premier5.0软件设计引物,应用PCR技术特异性地扩增出羊传染性脓疱病毒JLSY株的F1L基因片段,对PCR扩增产物使用变性高效液相色谱仪进行检测与分析,建立检测方法。进行了敏感性试验、特异性试验、稳定性试验和临床应用试验。结果表明：PCR-DHPLC检测方法能检测到最低拷贝数为103,其敏感性比常规PCR电泳法高100倍；对CEV基因组DNA和质粒标准品的检测结果为阳性,而对其它常见动物病毒基因组DNA的检测结果为阴性,表明本检测方法特异性较好。使用PCR-DHPLC方法和PCR电泳法对30份临床样本进行检测,两种方法阳性样品的检出符合率为100%。本研究建立的PCR-DHPLC检测方法敏感性更高,特异性更强,稳定性更好,可用于检测羊传染性脓疱病毒,为羊传染性脓疱病诊断提供是一种新方法。