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脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells,UC-MSCs）来源于新生儿出生后废弃的脐带组织,具有强大的自我更新能力和向脂肪细胞、骨细胞、神经细胞、肝细胞及肌细胞分化潜能。因其来源丰富,易于获取,且获取无创伤加之免疫原性低下,增殖能力强,无伦理性争议等优势,成为组织修复和器官重建理想的种子细胞来源,广泛应用于再生医学当中。临床研究中发现:间充质干细胞移植治疗组织损伤时,单次移植细胞数量高达到1×109个才能有效发挥治疗作用。另外干细胞再生医学研究中,为了保持实验结果的稳定性和可比性,需要大量的均一来源的种子细胞。因此如何高效规模化扩增具有原代生物学特征的间充质干细胞,成为干细胞再生医学研究和应用的基础和关键。本实验首先利用微载体结合生物反应器,建立了三维立体培养、规模化扩增人脐带间充质干细胞的专利技术。该技术操作简单,效率高,短时间内扩增的种子细胞高达109以上,避免了因细胞反复传代而导致的间充质干细胞老化、甚至恶变。细胞生物学、分子生物学和生物化学检测发现:三维立体培养的脐带间充质干细胞具有与平面培养的脐带间充质干细胞相同干细胞表面标志物的表达水平和增殖能力以及成脂肪、成骨及成软骨分化潜能。动物实验研究表明:三维立体培养的间充质干细胞具有与平面培养的间充质干细胞相类似的促进皮肤创伤愈合的能力。在干细胞移植修复小鼠皮肤损伤实验中,我们将人脐带间充质干细胞移植到正常小鼠的皮肤创面上。由于异种移植存在强烈的免疫反应,因此移植到小鼠皮肤创面上的人脐带间充质干细胞将会被小鼠自身的免疫反应排斥掉。但与对照组比较,移植人脐带间充质干细胞小鼠皮肤创面愈合率显著好于对照组,推测人脐带间充质干细胞可能通过旁分泌作用促进创面愈合。于是我们开展了人脐带间充质干细胞修复皮肤创伤的分子机制研究。外泌体（Exosomes,Ex）是细胞通过出芽方式而分泌的纳米级细胞膜包裹的囊性小泡,含有丰富的m RNA,micro RNA及蛋白质等成分。外泌体通过与靶细胞融合,将其中的内含物m RNA,micro RNA和蛋白质等成分注入到靶细胞中,调控靶细胞的增殖、迁移、凋亡。本实验首先采用超高速离心法从脐带间充质干细胞的条件培养基中分离出外泌体。透射电镜检测显示该外泌体直径约为40-100nm,呈圆形或卵圆形。Western blot显示该外泌体表达表面标志蛋白CD9及CD63。至此我们成功地获得了人脐带间充质干细胞源的外泌体（human unbilical cord mesenchymal stem cell exosomes,huc MSC-Ex）。为了检测外泌体是否通过改变表皮细胞的生物学行为促进皮肤创伤愈合。我们利用1m M过氧化氢（H2O2）诱导永生化角朊细胞（Ha Ca T）凋亡,建立了皮肤损伤细胞模型。细胞生物学行为检测发现huc MSC-Ex显著促进Ha Ca T增殖,呈时间-剂量效应关系,同时可以促进Ha Ca T的迁移,抑制H2O2诱导的Ha Ca T细胞凋亡。我们利用PKH26标记huc MSC-Ex后与Ha Ca T共培养,结果显示huc MSC-Ex可以进入Ha Ca T细胞浆中,可能发挥细胞交流的作用。为进一步探究huc MSC-Ex抑制H2O2诱导的Ha Ca T细胞凋亡的机制,我们首先对H2O2诱导Ha Ca T细胞凋亡的分子机制进行了探讨。Tunnel染色以及Annexin V-PI双染和流式细胞技术检测发现:加入H2O2后,Ha Ca T细胞凋亡明显增加,同时伴有凋亡诱导因子（Apoptosis inducing AIF）转位入核率增加。Western blot显示,加入H2O2后,Ha Ca T细胞线粒体中AIF、细胞色素C（Cytochrome c）表达显著下调,钙蛋白酶1（Calpain1）表达显著上调;细胞浆中细胞色素C、Caspase3表达显著上调,热休克蛋白70（Hsp70）表达明显下调;细胞核中多聚ADP聚合酶1（Poly（ADP-ribose）polymerase 1,PARP-1）表达、聚ADP核糖（Poly-（ADP）ribose,PAR）和亲环素A（cyclosporine A,Cy PA）表达显著上调。加入PARP-1抑制剂DPQ后,Ha Ca T细胞核内AIF和PAR表达下调,AIF转位入核率下降,细胞凋亡率明显下降。相反加入Caspas3抑制剂Ac-DEVD-CHO后,Ha Ca T细胞凋亡率没有显著下降。据此我们得出结论:H2O2通过Caspase非依赖线粒体凋亡信号通路,即AIF-PARP信号通路诱导Ha Ca T细胞凋亡。我们在Ha Ca T细胞凋亡模型中加入MSC同化培养基（huc MSC-CM）、huc MSC-Ex和去除外泌体的同化培养基（huc MSC-dp-Ex）。免疫荧光染色显示:与加入huc MSC-dp-Ex比加入huc MSC-CM或huc MSC-Ex显著降低Ha Ca T细胞凋亡数量和AIF转位入核数量。与免疫荧光染色相类似,加入huc MSC-CM或huc MSC-Ex显著下调降低PARP-1和PAR表达。至此我们得出如下结论:huc MSC-Ex通过AIF转位入核,下调PARP-1和PAR表达,通过Caspase非依赖的线粒体凋亡途径,抑制H2O2诱导的Ha Ca T凋亡。综上所述,我们通过建立微载体-生物反应器三维培养技术,高效规模化扩增了人脐带间充质干细胞。经过该技术扩增的间充质干细胞仍保留间充质干细胞表面标志物以及成脂、成骨和成软骨分化的多向分化潜能。移植人脐带间充质干细胞可以促进小鼠背部皮肤创面愈合。此项技术的建立为干细胞生物学和再生医学研究和应用提供了充足的具有可比性的种子细胞来源。我们利用超高速梯度离心技术,从人脐带间充质干细胞的条件培养液中收获了外泌体。进一步研究发现人脐带间充质干细胞来源的外泌体可以促进Ha Ca T细胞的增殖及迁移,抑制Caspase非依赖的线粒体凋亡信号通路,即AIF-PARP信号通路促进皮肤创面的修复,在皮肤创伤修复机制上形成了新的突破。外泌体来源丰富,易于获取,便于储存,移植后不诱发免疫排斥反应,有望成为重要的生物创新药。