功能性慢性内脏痛不仅严重影响病人的生活,而且因其发病机制不明,给治疗带来极大的麻烦。肠易激综合征(Irritable Bowel Syndrome,IBS)为功能性慢性内脏痛的典型代表。探索IBS及功能性慢性内脏痛的发病机制,并寻找行之有效的治疗手段为目前国内外研究热点。2000年Al-Chaer首次报道了IBS样慢性内脏痛大鼠模型,为研究IBS及功能性慢性内脏痛的发病机制提供了可借鉴的动物模型。然而,该模型制备过程中,新生鼠易死亡,成功率不高。因此,如何改进IBS样慢性内脏痛敏大鼠模型,提高模型成功率,为IBS及功能性慢性内脏痛的研究提供一个稳定、可靠的动物模型,将是十分必要的。大鼠降结肠和直肠的传入信息可通过腹下神经和盆神经传递到脊髓胸腰和腰骶节段。本课题组(美方)其他成员研究发现,IBS大鼠的内脏痛敏与脊髓中枢敏化有关;然而它是否与原发传入神经纤维敏化有关,尚有待于研究。此外,假设上述推论成立,那么胸腰和腰骶脊髓节段原发传入神经纤维敏化的特征是否一致或有何不同?探明这些问题,将有助于揭示IBS大鼠内脏痛敏的外周敏化机制并区分胸腰和腰骶背根传入在此过程的不同作用。有报道,结肠炎症产生的内脏痛觉过敏可由脊髓NMDA和非NMDA受体共同介导。另有报道,NMDA受体中NR2B亚单位可能在躯体疼痛发病机制中发挥重要作用。然而,NMDA与非NMDA受体在IBS样慢性功能性内脏痛敏形成中的作用,尚有待于探索。基于以上存在的问题,本研究改良了Al-Chaer模型,提高了建模的成功率,为IBS研究提供一个稳定、可靠的动物模型。籍此研究模型,探讨IBS大鼠脊髓胸腰和腰骶节段初级传入神经纤维的敏化作用以及脊髓腰骶神经元的敏化作用;进而探索NMDA和非NMDA受体在IBS样功能性慢性内脏痛敏中的作用,以期深化理解IBS及功能性慢性内脏痛的发病机制,为IBS的药物治疗提供新的作用靶点,为IBS的临床防治提供新的策略与途径。1 IBS样功能性慢性内脏痛模型的特点及评价1.1 Al-Chare模型的改进重复Al-Chare报道的方法造模,结果大鼠4 wk内的存活率不到30%。采用本文改进的造模方法,即减少伤害性结肠刺激(CI)的次数,仅在出生后第8、10、12天,给予乳鼠60 mmHg压力的CI刺激,每天1次,共3次,大鼠4 wk内的的存活率接近90%。提示改进造模方法,提高了造模的成功率。此模型组大鼠简称为CI大鼠。大鼠8 wk后,以结直肠扩张(CRD)引起腹壁撤退反射和腹外斜肌放电反应为指标,了解CI模型大鼠是否出现慢性内脏痛敏。1.2 CI大鼠腹壁撤退反射评分显著升高,痛反应阈显著降低。比较对照组与CI模型组成年大鼠在清醒状态下对不同强度(20、40、60、80 mmHg)的CRD刺激所产生的行为学变化。CI组大鼠在20 mmHg CRD刺激下即表现出明显的疼痛反应,其平均腹壁撤退反射(AWR)评分甚至超过对照组大鼠40 mmHg时的平均评分。CI大鼠在各个压力CRD下AWR评分均显著高于对照大鼠,尤其是在20与40mmHg较低压力刺激下评分增高更为显著。CI组大鼠痛反应阈较对照组显著降低。提示CI大鼠存在慢性内脏痛觉敏化现象。比较6 wk与12 wk CI模型组大鼠AWR评分及痛反应阈。虽然与同龄对照大鼠相比,20～60 mmHg CRD刺激下6 wk CI大鼠的AWR评分显著增高,痛反应阈明显降低;但不同周龄CI大鼠AWR评分之间无显著性差异。提示CI幼年大鼠即存在内脏痛觉敏化1.3 CI大鼠腹外斜肌肌电显著升高,肌电反应阈显著降低。比较对照与CI大鼠在清醒状态下对不同强度(20、40、60、80 mmHg)CRD刺激所引起的肌电反应。CI大鼠对20～80 mmHg各等级CRD刺激的肌电反应均较对照组显著增高,平均肌电反应阈显著降低。上述结果进一步证实了CI大鼠存在内脏痛觉敏化。1.4 CI大鼠躯体感觉敏感性增加为明确CI大鼠是否存在躯体感觉敏化,比较对照与CI成年大鼠在清醒状态下,双后肢足底皮肤对热刺激的敏感性差异。CI大鼠双后肢皮肤对热刺激反应的潜伏期较对照组显著缩短,提示CI大鼠相应的躯体皮肤对热刺激的敏感性增加。1.5 CI大鼠与对照大鼠体重的比较观察比较4～12周龄对照与CI大鼠在同一时期生长发育过程中体重的变化。结果表明,两组大鼠体重之间无显著性差异,提示造模本身对CI大鼠体重无明显影响。1.6 CI大鼠与对照大鼠腹泻与便秘体征的比较观察比较对照与CI大鼠生长发育过程中腹泻、便秘等体征的改变。对照大鼠无明显体征出现;但60 % 8 wk CI大鼠有腹泻或便秘体征。1.7 CI大鼠结直肠局部组织学的病理变化比较对照和CI大鼠远端降结肠和直肠的局部组织学的病理改变。对照与CI大鼠经过肉眼观察和显微镜检查,均未见明显病理改变。2 CI大鼠原发传入神经纤维对结直肠扩张反应显著增强2.1 CI大鼠结直肠扩张激活的胸腰和腰骶段传入神经纤维数目增加CI大鼠可以被CRD激活的传入神经纤维数量不论是在胸腰,还是在腰骶水平,均比对照大鼠显著增多。对照大鼠在腰骶水平记录到对CRD有反应的传入神经纤维数目比在胸腰水平记录到的显著增多,而CI大鼠被CRD激活的胸腰和腰骶段传入神经纤维的数量之间差别无显著性。2.2 CI大鼠胸腰和腰骶段传入神经纤维电紧张电位的改变与对照大鼠相比,CI大鼠腰骶段(LS)传入神经纤维(DR)电紧张电位(BKG)显著增高;而CI大鼠胸腰段(TL)DR电紧张电位无显著改变。对照大鼠TL DR(n=14)的平均电紧张电位显著高于LS DR(n=29);而CI大鼠,两者之间则无显著性差异。提示造模对LS DR的电紧张电位有显著影响,而对TL DR则无显著影响。2.3 CI大鼠胸腰和腰骶段传入神经纤维兴奋阈的改变与对照大鼠相比,CI大鼠LS DR对CRD刺激的兴奋阈显著降低。CI大鼠TL DR(n=126)对CRD的兴奋阈与对照大鼠TL DR (n=14)之间差异无显著性。对照大鼠TL DR与LS DR兴奋阈之间差异无显著性,而CI大鼠LS DR的兴奋阈显著低于TL DR,提示CI大鼠腰骶背根传入神经纤维兴奋阈改变较显著。2.4 CI大鼠胸腰和腰骶段传入神经纤维对CRD反应的改变2.4.1 CI大鼠腰骶传入神经纤维对各等级CRD反应显著增强比较对照与CI大鼠LS DR对相同强度CRD刺激的反应差异。CI大鼠LS DR对各个等级强度CRD刺激的平均反应强度均显著高于对照大鼠,提示CI大鼠腰骶高、低阈值的初级传入神经纤维均敏化。2.4.2 CI大鼠胸腰传入神经纤维对较高强度CRD反应显著增强比较对照与CI大鼠TL DR在相同强度CRD刺激下的反应。CI大鼠脊髓背根对40～80 mmHg CRD的平均反应较对照大鼠显著增高,提示CI大鼠胸腰高阈值的传入神经纤维敏化。2.4.3 CI大鼠腰骶传入神经纤维对各等级CRD反应显著高于胸腰传入比较TL和LS DR对CRD的反应。对照大鼠LS DR只对80 mmHg的CRD的平均反应显著强于TL DR;而CI大鼠LS DR对20～80 mmHg各个等级的CRD的平均反应都显著高于TL DR。提示CI大鼠LS DR对伤害与非伤害刺激反应的强度均显著高于TL DR,而对照大鼠LS DR仅对伤害性刺激反应的强度显著高于TL DR。3 CI大鼠脊髓神经元对内脏与躯体刺激的反应增强3.1 CI大鼠脊髓腰骶神经元对结直肠扩张刺激的反应增强比较对照与CI大鼠LS脊髓背角神经元对CRD刺激的反应。CI大鼠LS神经元对20～80 mmHg各个压力CRD的平均反应均显著高于对照大鼠。提示CI大鼠LS脊髓背角神经元对伤害与非伤害结直肠扩张刺激的反应显著增强。3.2 CI大鼠脊髓腰骶神经元对相应躯体刺激的反应增强比较对照与CI大鼠LS神经元对伤害与非伤害性各种不同躯体刺激的反应。与对照大鼠相比,CI大鼠LS神经元对伤害与非伤害性各种不同躯体刺激的反应均显著增强。提示CI大鼠除了出现慢性内脏痛敏,还伴随相应躯体感觉敏化。4谷氨酸受体在CI模型大鼠慢性内脏痛敏中的作用4.1 NMDA受体涉及IBS样功能性慢性内脏痛的形态学证据4.1.1 CI大鼠脊髓背根神经节NMDA受体NR2B亚单位表达增强采用免疫组织化学方法,比较对照与CI大鼠背根神经节NMDA受体NR2B亚单位的表达。图像分析结果,CI大鼠NR2B表达的平均光密度较对照组显著升高。提示CI大鼠背根神经节NMDA受体NR2B亚单位可能涉及IBS样功能性慢性内脏痛的外周敏化机制。4.1.2 CI大鼠脊髓内脏相关神经元NMDA受体NR2B亚单位表达增强采用免疫组织化学方法,比较对照与CI大鼠脊髓背角神经元NMDA受体NR2B亚单位的表达。图像分析结果,CI大鼠胸腰和腰骶段NR2B亚单位表达的平均光密度均显著高于对照大鼠。提示,CI大鼠脊髓NMDA受体NR2B亚单位可能涉及IBS样功能性慢性内脏痛的脊髓敏化机制。4.2 NMDA受体在IBS样功能性慢性内脏痛敏中的作用4.2.1腹腔注射AP-7显著抑制CI大鼠腰骶传入神经纤维对CRD刺激的反应本研究选用中等剂量AP-7 (0.5 mg/kg,i.p.),比较对照和CI大鼠给药前后LS DR对20～80 mmHg CRD的反应。结果显示,NMDA受体拮抗剂AP-7显著抑制对照和CI大鼠LS DR对20～80 mmHg CRD的反应),CI大鼠AP-7的抑制百分率显著高于对照大鼠。提示体内NMDA受体可能介导IBS样功能性慢性内脏痛敏。4.2.2脊髓局部给予AP-7显著抑制CI大鼠腰骶神经元对CRD刺激的反应4.2.2.1脊髓局部给予AP-7抑制CI大鼠腰骶神经元对CRD反应的百分数比较脊髓局部给予相同剂量AP-7在对照与CI大鼠之间对腰骶神经元产生效应的百分数。结果表明,相同剂量AP-7对CI组大鼠神经元产生效应的百分数较对照组大。4.2.2.2脊髓局部给予AP-7显著抑制CI大鼠腰骶神经元对CRD的反应比较脊髓局部给予不同浓度AP-7抑制对照与CI大鼠腰骶神经元对CRD刺激反应的程度。结果显示,与对照组大鼠相比,0.01 mmol AP-7则能剂量依赖性显著减弱CI组大鼠LS神经元对各压力等级CRD的平均反应。以上结果提示,脊髓NMDA受体参与介导IBS样功能性慢性内脏痛敏。4.3脊髓非NMDA受体在IBS样功能性慢性内脏痛敏中的作用4.3.1脊髓局部给予CNQX抑制CI大鼠腰骶神经元对CRD反应的百分数比较脊髓局部给予相同剂量CNQX在对照与CI大鼠之间对腰骶神经元产生效应的百分数。与对照大鼠相比,相同剂量CNQX对CI大鼠神经元产生效应的百分数较大。4.3.2脊髓局部给予CNQX抑制CI大鼠腰骶神经元对CRD的反应比较脊髓局部给予不同浓度CNQX抑制对照与CI大鼠腰骶神经元对CRD刺激反应的程度。结果,与对照大鼠相比,2μmol CNQX就显著降低CI大鼠腰骶神经元对所有等级CRD的平均反应,同时2～10μmol CNQX呈剂量依赖性显著减弱神经元对伤害性和非伤害性CRD的平均反应。以上结果提示,脊髓非NMDA受体参与介导IBS样功能性慢性内脏痛敏。综上所述,本工作提示:1.改进后的CI模型制作方法可提高建模的成功率。CI模型大鼠慢性内脏痛敏显著,且伴有腹泻、便秘症状与牵涉痛,其结直肠局部组织未见明显的病理改变。提示本CI模型可做为IBS样功能性慢性内脏痛的研究模型。2.IBS样功能性慢性内脏痛大鼠存在外周传入神经纤维敏化。与胸腰背根在结肠急性伤害性传入的作用相比,其在结肠慢性痛觉敏化过程中可能发挥了更大作用;而腰骶背根传入在急性与慢性痛觉敏化过程中可能发挥了同等重要的作用。3.新生期的结肠伤害性刺激敏化了成年大鼠腰骶神经元对结直肠扩张刺激的反应,即IBS样功能性慢性内脏痛大鼠存在脊髓背角神经元敏化。4. CI大鼠背根神经节和脊髓内脏相关神经元NMDA受体NR2B亚单位表达增强,这为NR2B亚单位可能涉及功能性慢性内脏痛的外周和脊髓敏化机制提供形态学基础。脊髓NMDA受体和非NMDA受体参与介导功能性慢性内脏痛敏作用。此外,似乎还提示功能性慢性内脏痛时,脊髓与内脏痛觉相关的离子型谷氨酸受体功能可能更多地被激活。