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聚酮合酶(Polyketide synthease, PKS)在红曲菌(Monascus spp.)的代谢中可催化产生大量的聚酮化合物(Polyketide),主要包括红曲色素、Monaclin K和桔霉素。目前NCBI上已经提交了红曲菌的Monaclin K和桔霉素的生物合成基因簇,而控制红曲色素合成的pks基因的克隆还未见报道。通过克隆红曲菌中潜藏的pks基因,为红曲菌聚酮合成途径的进一步研究奠定基础。本研究通过简并PCR的方法从红色红曲菌(Monascus ruber) M-7中克隆得到了一个pks基因片段,将其命名为Mrpksl0,并通过基因敲除技术对其功能进行了初步研究,主要实验内容如下：1.Mrpks10基因的克隆及序列分析根据与红曲菌亲缘关系较近物种的pks的KS功能域DNA序列和氨基酸序列的保守序列,设计了一对简并引物,克隆得到了约700bp的Mrpks10基因片段,并在此基础上,结合常规PCR和SON-PCR向该基因的两侧延伸,最终获得了11787bp的DNA序列,该序列包含了两个基因,其中序列较长的那个基因即为目的基因,该基因ORF长度为7304bp,包含了10个外显子,9个内含子,预测编码2038个氨基酸。该基因与紫色红曲菌(Monascus purpureus)pksl (AJ414729,7144bp)的DNA序列高度同源,相似性高达91%。将其内含子去除后进行BlastX比对,通过分析预测,该基因可能与红曲菌产色素的合成有关。根据预测的氨基酸序列分析,Mrpks10是由KS (Ketoacyl synthase), AT (Acyl transf erase), ACP (Acyl carrier protein)以及TE (Thioesterase)四个功能域组成,且属于非还原PKS类(Non-reducing PKS)。2. Mrpksl0基因的敲除以潮霉素抗性基因为筛选标记,构建了Mrpks10的同源重组敲除载体,并采用农杆菌介导的转化方法转化M-7,然后通过PCR从转化子中分离筛选出敲除子,并采用Southern杂交技术对其进行进一步验证,得到了一株敲除突变子ΔMrpks10。3.Mrpks10功能的初步分析为进一步明确该基因在M-7生长发育过程中的作用,对△Mrpksl0进行了相关基本生物学性状的研究,包括了菌落的颜色和形态的观察、分生孢子、闭囊壳以及菌丝结构的观察、桔霉素与胞内、胞外红曲色素含量的测定。结果表明,△Mrpksl0与M-7在这些生物学性状上没有明显的差异,从而初步推测Mrpksl0可能发生了基因沉默。为确定该基因确实发生了沉默,通过RT-PCR进一步加以验证,结果表明该基因确实在(?)nRNA水平不能表达。