背景与目的：　　气道高敏感反应是呼吸道对物理、化学和病理刺激异常敏感，对正常不应该出现收缩反应的刺激发生异常反应。此类病人麻醉中发生呼吸系统并发症危险性显著增加，其中以支气管痉挛威胁最大。气道高敏感反应发病机制复杂，至今尚未完全清楚。主要是由敏感个体对环境中正常抗原产生异常免疫应答，这种异常的免疫应答主要由CD4+T辅助细胞中的Th2细胞引起。变应原激活T淋巴细胞，增殖分化为Th2细胞，产生IL-4、IL-6、IL-10、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子、肿瘤坏死因子a(TNFa)等细胞因子，促进B细胞增殖及免疫球蛋白类型转换，生成IgE及IgG1，与肥大细胞及嗜碱粒细胞膜上受体结合，使细胞脱颗粒，释放出组胺、血小板活化因子(PAF)、蛋白水解酶、激肽原酶、嗜酸粒细胞趋化因子(ECF)、中性粒细胞趋化因子(NCF)及花生四烯酸代谢产物(LTB4、LTC4、PDG2等)。病理改变以毛细血管扩张、血管通透性增加、平滑肌收缩和嗜酸粒细胞浸润为主要特点，晚期还可出现气道重建。气道高敏感反应受多种细胞因子的调节，众多细胞因子相互作用，其中转化生长因子-β(TGF-β)家族在气道高敏感反应中起重要作用。　　骨形态构建蛋白(BMPs)最初因为在骨及软骨形成中起作用而被发现并命名，在其它重要组织器官（如心、肺、脑等）也有表达，对多种细胞的增殖、分化、迁移、凋亡具有调控作用，在胚胎气道分支及肺发育中起关键作用。BMPs是转化生长因子β(TGF-β)超家族重要成员之一。在气道高敏感反应中，TGF-β1可以激活Smads和MAPK（分裂原激活的蛋白激酶）两种途径，Smads蛋白转导的核转录途径主要表现为抑制炎症反应，而MAPK转导的转录途径则表现为促进增殖反应;目前已知肺动脉平滑肌细胞中，BMPs同样存在Smads和MAPK两种下游途径，Smads途径抑制炎症与增殖反应而MAPK途径促进炎症与增殖反应，这两种途径的平衡状态决定促进或抑制细胞增殖反应。研究表明，BMPs与TGF-β1共同参与许多疾病的调节，BMPs是否也参与气道高敏感反应，并激活Smads及MAPK两种途径目前尚不清楚。本研究通过建立小鼠气道高敏感反应模型，检测肺组织BMP-2，BMPRⅠ、Ⅱ，及其下游途径Smad-1、P38 MAPk表达，探讨BMP-2、受体及其下游途径与气道高敏感反应的关系。应用在体转染RNA干扰技术，沉默BMP-2基因，检测Smads、MAPK途径表达，讨论气道高敏感反应中Smad-1、P38 MAPk变化是否与BMP-2有因果关系。　　材料和方法：　　1、分组　　8～12周雄性Balb/c小鼠30只，质量20～22g，随机分为3组。Ⅰ组为健康对照组(n=10):小鼠在0和7d腹腔注射氢氧化铝2mg（溶于生理盐水0.3 ml），于14，21，22 d用生理盐水雾化吸入，每天1次，每次30min。末次雾化吸入后腹腔注射戊巴比妥钠50mg/kg麻醉，内眦静脉取血，离心取血清，-20℃保存。开胸，取左肺用10％多聚甲醛固定，右肺置液氮中保存。Ⅱ组为气道高敏感反应模型组(n=10):小鼠在0和7d腹腔注射由卵清蛋白(ovalbumin，OVA)20μg加氢氧化铝2mg溶于生理盐水0.3 ml配成抗原混悬液致敏，于14，21，22 d用20mg/mlOVA雾化吸入，每天1次，每次30min，末次雾化吸入后麻醉、取血清及肺处理同Ⅰ组。Ⅲ组为在体转染组(n=10):小鼠在0和7d腹腔注射由卵清蛋白20μg加氢氧化铝2mg溶于生理盐水0.3ml配成抗原混悬液致敏，于7d经气管注入由腺病毒载体携带的siRNA，于14，21，22 d用20mg/mlOVA雾化吸入，每天1次，每次30min，末次雾化吸入后麻醉、标本采集同Ⅰ、Ⅱ组。　　2、应用在体转染RNA干扰，沉默BMP-2基因。　　BMP-2基因靶点设计、有效靶点筛选与验证、构建载体并包装成腺病毒。在体转染组0、7d腹腔注射OVA致敏，7d于戊巴比妥钠麻醉后，经22G导管气管内注入108TU/ml BMP-2siRNA的腺病毒载体50μl转染，14d进行活体荧光检测转染病毒在肺内分布情况。　　3、ELISA法检测 IL-4(pg/ml)　　IL-4水平的检测参照ELISA检测试剂盒中提供的操作说明。即将待测样品和不同稀释度的标准品各100μl加至相应孔中，孵育、洗涤后，依次加入检测工作液100μl/孔（孵育、洗涤）及底物A、B各50μl/孔。显色、中止后，于波长450 nm用酶标仪测量A值，并绘制标准曲线。以不加血清的孔为对照，从标准曲线上即可获得血清中IL-4的含量。　　4、OVA特异性Ig-E(A value)检测　　血清OVA特异性IgE(sIgE)水平检测参照ELISA检测试剂盒中提供的操作说明。即以10g/L OVA包被酶标板，依次加待测血清及HRP抗IgE mAb。用联苯二胺底物液显色后，于波长490 nm用酶标仪测量定吸光度值。阴性对照孔为不加待测样本和HRP抗IgE mAb。　　5、气道形态学测定　　每只小鼠分析2个HE染色肺组织切片，用病理图像分析仪及软件测定支气管基底周径(D)，管腔面积(A1)及平滑肌层面积(A2)，并用D将测量值标准化，分别用A1/D，A2/D比较各组支气管内径及管壁变化情况（像素/μm）。　　6、气管血管旁嗜酸性粒细胞(EOS)的检测　　左肺组织切片经苏木精伊红(HE)染色，观察嗜酸性粒细胞浸润程度。评定标准:选取气管血管旁无肺泡组织的环行区域（其中气管直径≤1000μm，有伴行血管），以该环行区域的面积为A0，内含的气管及血管面积分别为A1、A2。400倍镜下计数该气管血管旁EOS数目，得出相应气管血管旁单位面积EOS数目为:EOS个数/[A0-(A1+A2)](单位:个/mm2)，采用计算机病理图像分析软件Leica Qwin处理分析。　　7、杯状细胞增生指数及黏液储备指数的检测　　切片过碘酸雪夫(PAS)染色，选取直径≥700μm的气道，计数该气道杯状细胞个数，测量气道壁周长，以单位周长上的杯状细胞个数为增生指数(单位:个/mm)。测量气道上皮PAS阳性着色细胞面积/气道壁的总面积值为黏液储备指数（单位:％）。　　结果：　　1、气道高敏感反应检测　　(1)血清学检测，与对照组相比较，实验组血清IL-4及OVA特异性IgE水平明显升高(p＜0.01)。转染组IL-4及IgE水平也较对照组有所升高(p＜0.05)，但低于实验组(p＜0.05)。　　(2)组织学检测，对照组支气管上皮形态完好、排列规则、管腔正常;而实验组支气管上皮细胞肿胀，部分脱落，支气管内径缩小，甚至呈菊花样改变，平滑肌层增厚;转染组支气管内径也一定程度缩小。实验组支气管黏膜下及肺泡间隔嗜酸性粒细胞大量浸润，杯状细胞增生肥大，并有大量黏液生成;转染组有少量嗜酸性粒细胞浸润，而对照组未见嗜酸性粒细胞浸润、杯状细胞增生及黏液形成。各组间比较均有统计学意义(P＜0.05)。　　2、肺组织BMP-2，BMPR-Ⅰ、Ⅱ，P-Smad1/5，P-p38MAPK蛋白表达　　健康肺组织BMP-2蛋白表达水平较高，而实验组则有进一步升高（2倍）转染组仅有弱表达;实验组BMPR-Ⅰ蛋白表达也较对照组明显升高（3倍），转染组表达较实验组低（P＜0.05）;三组BMPR-Ⅱ表达无差别;实验组P-Smad1/5和P-p38MAPK均有高表达，对照组则几乎无表达，转染组表达低于实验组。　　3、肺组织BMP-2，BMPR-Ⅰ、Ⅱ，Smad1，p38MAPKmRNA表达　　健康肺组织BMP-2mRNA表达水平较高，而实验组则有进一步升高（3倍），转染组仅有弱表达;实验组BMPR-Ⅰ mRNA表达也较对照组明显升高（2.5倍），转染组表达较实验组低（P＜0.05）;三组BMPR-ⅡmRNA表达无差别;实验Smad1和p38NAPKmRNA均有高表达，对照组则几乎无表达，转染组表达低于实验组。　　结论：　　1、BMP-2参与了气道高敏感反应。　　2、BMP-2两条下游途径Smads和MAPK在高敏感反应中活化。　　3、气道高敏感反应中，BMP-2参与激活Smads及MAPK信号途径。　　4、气道高敏感反应可能有多种细胞因子参与调节，单独沉默BMP-2基因，不能阻断其发生。