论文部分内容阅读
细胞凋亡(Apoptosis)又称之为细胞程序性死亡(Programmedcelldeath,PCD),是指基因所控制的细胞主动并有序的死亡过程。细胞凋亡在机体的发育、进化、器官分化以及维持内部环境的稳定等发挥关键的作用。目前对于线虫等低等动物中细胞凋亡机制的研究已经比较深入,而昆虫及高等哺乳动物中凋亡机制则较为复杂,部分机制尚未明确。线粒体凋亡通路在昆虫凋亡机制中的作用更为重要,在果蝇中目前已鉴定了5个与线粒体相关的凋亡蛋白,它们的主要作用是拮抗凋亡抑制蛋白(Inhibitapoptosisprotein,IAP),而引起细胞凋亡。
在家蚕(Bombyxmori)中,目前只鉴定到一个IAP拮抗蛋白IBM1。它是果蝇Reaper的同源蛋白。根据NCBI数据库中家蚕ibm1基因序列特异性的引物,通过反转录PCR(ReversetranscriptionPCR,RT-PCR)方法扩增ibm1基因,并且将PCR扩增片段连接到pMD18-simpleT载体上,进行测序。结果表明,该基因片段的阅读框为279bp,编码93个氨基酸。
为了检测家蚕IBM1的凋亡功能,将含有增强型绿色荧光蛋白(Enhancedgreenfluorescentprotein,eGFP)的载体与IBM1、IE2、IAP2分别进行共转染,采用吖啶橙/碘化丙啶(AcridineOrange/PropidiumIodide,AO/PI)双染色分析,结果发现IBM1具有显著的促凋亡作用,并且与表达抑制凋亡蛋白重组载体共转染之后凋亡作用有明显的降低。将Ibm1基因片段克隆到pFastBacl-eGFP载体中,构建eGFP融合蛋白,生成重组病毒pFastBacl-IBM1-eGFP,进行亚细胞定位分析。结果表明IBM1重组病毒定位于线粒体,同时通过JC-1染色分析,发现IBM1可以导致线粒体膜电位的降低。
应用实时定量PCR(Real-timequantitativePCR,Q-PCR)技术检测Ibm1的表达变化。家蚕细胞(BmN)及蚕蛹中的Ibm1在家蚕核型多角体病毒(Bombyxmorinucleopolyhedrovirus,BmNPV)感染后2小时表达量明显提升并且达到峰值,表达量从感染4小时后开始降低,直至8小时时恢复正常水平。通过对出芽型病毒粒子(BuddedVirus,BV)产量及CCK-8细胞增殖检测法(CellCountingKit-8)的分析发现,IBM1重组病毒相对于野生病毒BmNPV感染家蚕细胞后所产生的病毒滴度大幅降低。CCK-8分析结果同样表明了IBM1的表达可以起到抑制病毒感染的作用。共定位(Co-localisation)及双向抗体检测的免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)结果显示,IBM1可以和BmNPV的IAP2相互作用。这是本研究第一次报道,家蚕RHG蛋白可以与杆状病毒中的抑制凋亡蛋白直接相互作用。