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结核病(TB)是由结核分枝杆菌(Mtb)感染引起的慢性传染性疾病。近年来，由于人口流动性增加，艾滋病蔓延以及Mtb耐药菌株出现等，全球结核病疫情日益加重，全球每年新发结核病例1000万人，死亡人数高达150万，居致死性感染疾病之首。目前中国结核病死亡人数为3.7万，处于结核病高负担国家前列，因此，结核防治是我国仍需面临的重大公共卫生问题。巨噬细胞是Mtb进入机体的第一道防线，然而讽刺的是，Mtb经长期进化已形成多种调控机制抵御巨噬细胞的杀伤(如抑制吞噬、降低自噬、阻碍凋亡、抑制炎症等)，使得巨噬细胞不仅丧失了清除Mtb的能力，甚至沦为Mtb躲避机体免疫应答的避难所。近年来，诸多毒力因子被报道参与Mtb免疫逃逸，这些分子通过调控巨噬细胞的免疫功能，增加Mtb在宿主中的生存。然而，Mtb毒力因子的免疫逃逸机制尚不完全清楚。因而，深入探究毒力因子在巨噬细胞中的功能，既可为研究新型结核疫苗寻找潜在的抗原，又可为预防和治疗结核病的药物提供新的靶点。
SapM是Mtb重要的分泌型毒力因子，是由H37Rv的3310位基因编码的一种酸性磷酸酶，主要催化PI3P。研究表明，Mtb感染吞噬细胞后，SapM能够调控包裹Mtb的吞噬小体形成及与溶酶体融合过程，从而逃避宿主溶酶体的降解。与野生型Mtb相比，SapM缺失株感染豚鼠后，其肺部病理改变明显减轻，细菌载量明显下降。同时，SapM还可协助Mtb躲避机体免疫应答。用缺失SapM的BCG免疫小鼠，可以有效激活吞噬细胞(树突状细胞)，并促进其抗原提呈能力。目前对于SapM促进吞噬细胞Mtb存活的机制尚不清楚。因而，本文就SapM在巨噬细胞中的功能及机制进行了详细探究。
首先，为研究SapM在巨噬细胞中对Mtb生存的影响，本文第一部分以过表达SapM的耻垢分枝杆菌(Ms∷SapM)作为研究工具，建立体外细胞及体内小鼠Ms感染模型，结果发现，Ms在不同时间点(8H，24H，48H)感染小鼠RAW264.7细胞后，SapM组巨噬细胞中细菌载量较空载组分别升高1.2，1.28及2倍左右。体内结果表明，与空载组相比，过表达SapM的Ms感染小鼠后，其肺脏、脾脏及肝脏的细菌载量明显升高，提示我们SapM能够促进巨噬细胞内Ms的存活。为进一步证实这个结论，我们以过表达SapM的RAW264.7(RAW-SapM)细胞为研究工具，建立体外BCG感染模型，观察过表达SapM对巨噬细胞中BCG存活的影响。结果发现，与RAW-Vector组相比，BCG感染的RAW-SapM组在不同时间点(8H、24、48H)细菌载量均升高2倍左右，提示SapM能够促进BCG在巨噬细胞中的存活。
本文第二部分研究SapM对于巨噬细胞自噬的影响。自噬是巨噬细胞参与清除病原体的重要生理过程。现已报道，多种胞内菌(如产单核细胞李斯特菌、福氏志贺菌、伯克氏菌等)感染均可引起细胞发生自噬，从而影响其在细胞中的存活。自噬是清除巨噬细胞中Mtb的重要途径。而Mtb的毒力因子(如PEPGRS47、HBHA、Eis等)在调控巨噬细胞自噬，促进Mtb的生存被广泛报道。SapM是PI3P的磷酸酶，PI3P通过影响下游自噬分子的招募从而调控自噬的起始阶段。以往研究发现，巨噬细胞中过表达SapM能与Rab7结合抑制自噬体和溶酶体的融合。但是SapM在巨噬细胞中调控自噬起始的机制尚不清楚。因而，通过外源药物雷帕霉素(Rapa)刺激、过表达SapM的Ms感染及敲除SapM的H37Rv感染巨噬细胞，均发现SapM有效抑制Rapa诱导、Ms感染及Mtb感染引起的巨噬细胞自噬。这与以往报道SapM能够抑制巨噬细胞发生自噬相符。为了研究这种抑制现象是否发生在自噬的起始阶段，我们外源加入氯喹(抑制自噬体及溶酶体融合)，通过Rapa刺激过表达SapM的巨噬细胞，发现SapM抑制自噬的现象依然存在，这提示我们SapM确实抑制自噬的起始阶段。SapM有两个磷酸酶活性位点His93和His204，进一步探究自噬的抑制现象是否依赖于SapM的磷酸酶活性，我们将SapM93及204位点的His突变为Ala，并构建与之对应的Ms过表达菌(Ms∷SapMHA93、Ms∷SapMHA204、Ms∷SapMHDA)。通过感染巨噬细胞发现，与未突变Ms菌相比，磷酸酶位点突变的Ms菌感染引起的自噬明显升高。这提示我们点突变后自噬抑制现象发生了回补，说明SapM抑制自噬是磷酸酶活性依赖的。
本文第三部分，通过免疫共沉淀的方法发现SapM与mTOR直接结合，并发生共定位现象。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是导致自噬发生的重要节点，在自噬起始阶段发挥重要作用。抑制mTOR，导致mTOR转移至内质网(ER)，促进ULK1复合物磷酸化，诱导细胞自噬。进一步探究其具体机制后发现SapM通过激活mTOR的活性，调控下游蛋白ULK及p70S6K的磷酸化，抑制巨噬细胞自噬的起始。进一步对SapM及mTOR的功能域进行分析发现，SapM主要通过其164-299aa/His204位点与mTOR的FAT、HEAT1、KINASE结构域结合，从而影响细胞自噬的发生。
综上所述，我们的研究创新性的发现与Mtb毒力因子SapM相互结合的蛋白mTOR。SapM进入胞质后，能与mTOR结合，影响自噬的起始，从而抑制自噬的发生，最终促进Mtb在巨噬细胞中的存活。全面分析和研究SapM在巨噬细胞中的功能，为开发新型结核治疗的潜在药物靶点奠定坚实的基础。
SapM是Mtb重要的分泌型毒力因子，是由H37Rv的3310位基因编码的一种酸性磷酸酶，主要催化PI3P。研究表明，Mtb感染吞噬细胞后，SapM能够调控包裹Mtb的吞噬小体形成及与溶酶体融合过程，从而逃避宿主溶酶体的降解。与野生型Mtb相比，SapM缺失株感染豚鼠后，其肺部病理改变明显减轻，细菌载量明显下降。同时，SapM还可协助Mtb躲避机体免疫应答。用缺失SapM的BCG免疫小鼠，可以有效激活吞噬细胞(树突状细胞)，并促进其抗原提呈能力。目前对于SapM促进吞噬细胞Mtb存活的机制尚不清楚。因而，本文就SapM在巨噬细胞中的功能及机制进行了详细探究。
首先，为研究SapM在巨噬细胞中对Mtb生存的影响，本文第一部分以过表达SapM的耻垢分枝杆菌(Ms∷SapM)作为研究工具，建立体外细胞及体内小鼠Ms感染模型，结果发现，Ms在不同时间点(8H，24H，48H)感染小鼠RAW264.7细胞后，SapM组巨噬细胞中细菌载量较空载组分别升高1.2，1.28及2倍左右。体内结果表明，与空载组相比，过表达SapM的Ms感染小鼠后，其肺脏、脾脏及肝脏的细菌载量明显升高，提示我们SapM能够促进巨噬细胞内Ms的存活。为进一步证实这个结论，我们以过表达SapM的RAW264.7(RAW-SapM)细胞为研究工具，建立体外BCG感染模型，观察过表达SapM对巨噬细胞中BCG存活的影响。结果发现，与RAW-Vector组相比，BCG感染的RAW-SapM组在不同时间点(8H、24、48H)细菌载量均升高2倍左右，提示SapM能够促进BCG在巨噬细胞中的存活。
本文第二部分研究SapM对于巨噬细胞自噬的影响。自噬是巨噬细胞参与清除病原体的重要生理过程。现已报道，多种胞内菌(如产单核细胞李斯特菌、福氏志贺菌、伯克氏菌等)感染均可引起细胞发生自噬，从而影响其在细胞中的存活。自噬是清除巨噬细胞中Mtb的重要途径。而Mtb的毒力因子(如PEPGRS47、HBHA、Eis等)在调控巨噬细胞自噬，促进Mtb的生存被广泛报道。SapM是PI3P的磷酸酶，PI3P通过影响下游自噬分子的招募从而调控自噬的起始阶段。以往研究发现，巨噬细胞中过表达SapM能与Rab7结合抑制自噬体和溶酶体的融合。但是SapM在巨噬细胞中调控自噬起始的机制尚不清楚。因而，通过外源药物雷帕霉素(Rapa)刺激、过表达SapM的Ms感染及敲除SapM的H37Rv感染巨噬细胞，均发现SapM有效抑制Rapa诱导、Ms感染及Mtb感染引起的巨噬细胞自噬。这与以往报道SapM能够抑制巨噬细胞发生自噬相符。为了研究这种抑制现象是否发生在自噬的起始阶段，我们外源加入氯喹(抑制自噬体及溶酶体融合)，通过Rapa刺激过表达SapM的巨噬细胞，发现SapM抑制自噬的现象依然存在，这提示我们SapM确实抑制自噬的起始阶段。SapM有两个磷酸酶活性位点His93和His204，进一步探究自噬的抑制现象是否依赖于SapM的磷酸酶活性，我们将SapM93及204位点的His突变为Ala，并构建与之对应的Ms过表达菌(Ms∷SapMHA93、Ms∷SapMHA204、Ms∷SapMHDA)。通过感染巨噬细胞发现，与未突变Ms菌相比，磷酸酶位点突变的Ms菌感染引起的自噬明显升高。这提示我们点突变后自噬抑制现象发生了回补，说明SapM抑制自噬是磷酸酶活性依赖的。
本文第三部分，通过免疫共沉淀的方法发现SapM与mTOR直接结合，并发生共定位现象。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是导致自噬发生的重要节点，在自噬起始阶段发挥重要作用。抑制mTOR，导致mTOR转移至内质网(ER)，促进ULK1复合物磷酸化，诱导细胞自噬。进一步探究其具体机制后发现SapM通过激活mTOR的活性，调控下游蛋白ULK及p70S6K的磷酸化，抑制巨噬细胞自噬的起始。进一步对SapM及mTOR的功能域进行分析发现，SapM主要通过其164-299aa/His204位点与mTOR的FAT、HEAT1、KINASE结构域结合，从而影响细胞自噬的发生。
综上所述，我们的研究创新性的发现与Mtb毒力因子SapM相互结合的蛋白mTOR。SapM进入胞质后，能与mTOR结合，影响自噬的起始，从而抑制自噬的发生，最终促进Mtb在巨噬细胞中的存活。全面分析和研究SapM在巨噬细胞中的功能，为开发新型结核治疗的潜在药物靶点奠定坚实的基础。