柑橘黄龙病(CitrusHuanglongbing,HLB)是全球范围内柑橘产业上威胁最大的病害之一,其病原为韧皮部限制性难培养革兰氏阴性菌。外膜蛋白在许多革兰氏阴性菌的致病过程中起重要作用。本课题在我们实验室前期研究的基础上,对具有激发子功能的MotB外膜蛋白基因进行进一步的研究,明确该基因在本氏烟和大肠杆菌中的亚细胞定位及表达特性,取得的主要研究成果如下:1.MotB外膜蛋白基因及其缺失跨膜结构域△tMotB基因在本氏烟(Nicotiana benthamian)中亚细胞定位:采用Gateway技术分别将目的基因(MotB,△tMotB)构建至入门载体pDONRrM/Zeo及植物表达载体pMW390中,采用农杆菌浸润注射接种本氏烟的叶片背面,于接种后48-72 h激光共聚焦观察荧光,结果发现MotB外膜蛋白基因及其缺失跨膜结构域△tMotB基因均在本氏烟的细胞核和胞质处有荧光信号。2.MotB及△tMotB基因引起的本氏烟中10个HR标志基因的表达情况:采用荧光定量 PCR 分析结果表明,SIPK、WIPK、BAK1、RbohB、TOBPAL、ACRE31 基因均基本表现相同趋势,且在2 dpi时表达量最高均呈现上调表达。△tMotB基因与MotB基因相比,基因变化值小。0.5-2 dpi相对表达量低,而4-6 dpi相对表达量高。接种△tMotB基因的烟草,质蓝素Plastocyanin呈上调表达;而接种MotB基因的烟草中Plastocyanin呈下调表达。3.原核表达载体的构建和多克隆抗体的制备:利用双酶切技术将MotB基因构建到表达载体pET-28a(+)上,同时将△tMotB基因分别构建到pET-22b(+)和pET-28b(+)上,SDS-PAGE结果显示,三种重组载体中不含跨膜结构域的△tMotBB-22b与△tMotB-28b重组载体能够在16 ℃,0.5 mmol/L IPTG条件下诱导20 h后获得大量可溶性目标融合蛋白,而含有跨膜结构域的MotB在pET-28a(+)载体上不能表达,通过Ni-NTA纯化后获得目的蛋白交付武汉百意欣生物科技有限公司制备了特异性和效价高的多克隆抗体。4.MotB外膜蛋白在E.coli中的定位与泌出性分析:利用不依赖于连接反应克隆(LIC)技术成功构建了原核表达载体MotB-1GFP与△tMotB-1GFP,并于28 ℃,0.1mmol/LIPTG条件下诱导10h后,对菌液进行处理,激光共聚焦观察到目标融合蛋白MotB定位在大肠杆菌的两极,而缺失跨膜结构域的△tMotB蛋白及空载体1GFP则在大肠杆菌中表现为均匀分布,说明跨膜结构域对该基因在E.coli中的定位起重要作用。SDS-PAGE和Western blot分析结果显示,含有GFP的目标融合蛋白MotB并未分泌到胞外。