研究背景肾母细胞瘤(Wilms tumor)又称肾胚胎瘤(embryonic tumor of kidney),又称Wilms瘤(WT),是小儿中最常见的腹膜后的恶性实质性肿瘤之一,其发病率于小儿腹部实体肿瘤中占第一位,特别是在15岁以下的小儿泌尿生殖系统肿瘤中占有很大比例,占80%以上,主要发生在生后前5年内,2-4岁多见。左右两侧发病率几乎相同,但是双侧肿瘤同时发病比较少,其约占肾母细胞瘤总发病率的3-10%,相继或同时发生。男女性患儿的发病率几乎无差别,但是有很多研究表明男性患儿发病率略高于女性患儿。目前为止大家认为分型及分期是影响患儿预后的主要因素,与肿瘤具体大小无明显关系。早期的诊断对于肾母细胞瘤的治疗方式以及患儿治疗后的效果具有重要意义。肾母细胞瘤患儿的早期临床表现不明显,而且因为其发病年龄较低,患者多数为小儿或婴儿,容易受家长或医生的忽视而导致其就医时间延迟,诊断明确延迟。目前的检查方法主要是：超声检查、CT及磁共振及排泄性尿路造影(IVU)等,并结合临床诊断,才能基本确定肾母细胞瘤,而明确诊断要靠病理诊断,病理诊断是检查的金标准,理想的早期诊断手段正在探索中。目前运用于肾母细胞瘤血液检查初步诊断的相关性标记物的敏感性和特异性都比较差,诊断价值有限。上述各种相关情况决定了现无论在手术还是化疗、放射治疗抑或生物治疗上,对中晚期的。肾母细胞瘤患儿的治疗是临床上的重点,如此也必然会直接影响到治疗后的效果。据了解美国国家肾母细胞瘤研究协作组研究表明,与治疗方法无关,肾母细胞瘤患儿的生存率是随着肿瘤分期的升高而下降,故中晚期患儿面临巨大的死亡风险。由此我们可以看出,依靠现有的实验技术找寻一种简便、易行、准确的早期检测方法检测小儿肿瘤以使肾母细胞瘤患儿能够得到早期诊断而更早的治疗并获得长期生存率是现在小儿外科医学迫切要求的。最早于1994年蛋白质组学这一概念被提出后就获得了大量的认可和研究。本质上是指在大规模的水平上通过特殊方法研究蛋白质的特征。无论是量还是质的变化,任何的疾病、任何机体活动在蛋白质水平上都会发生改变。因此我们可以根据蛋白质水平变化建种以监测某种疾病的特异性蛋白质水平量或质的变化以达到对该种疾病早期诊断的目的的诊断系统,这也是现在临床医生和科研工作者对于疾病,特别是肿瘤的早期诊断的一个特殊的重要的研究方向。而找寻对应某种疾病发生发展的特异性蛋白质则成了研究的核心问题。随着蛋白质组学研究技术的更新发展,许多疾病蛋白质标记物被检测出并鉴定。在药物目标靶点和疾病特异蛋白质标记物筛选中应用蛋白组学的研究方法被人们认为是最有效果和便捷的方法之一,由此我们可以看出,该相关技术为寻找准确简便可行的肾母细胞瘤筛查和早期检测手段提供了一种可能。蛋白质组学技术可快速高通量的筛查检测疾病发生的不同阶段基因表达的蛋白质表达情况,从而检测到有诊断意义的特异蛋白质标记分子,而这些高表达的特异蛋白能为早期诊断提供依据,也可能为疾病的治疗提供靶点,将有望更好地服务于临床。2002年科研工作者发明了表面增强激光解吸电离飞行时间质谱仪器(SELDI-TOF-MS),蛋白质芯片技术由此已广泛用于各类疾病特异性蛋白标志物的筛选及检测,在不断发展中取得了一系列突破性研究进展。该研究方法有许多优点,其灵敏度高、操作简便、快速高通量、样品用量小,通过结合LC-MS/MS、 MALDI-TOF-MS等新技术已经鉴定出了诸多肿瘤如乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤血清中的特异性蛋白质。本研究是应用SELDI技术检测肾母细胞瘤患儿病例血清、创伤应激患儿血清及正常小儿血清中的蛋白,筛选出特异性高表达的蛋白质,并应用质谱相关技术对筛选出的特异性蛋白质进行鉴定,找出创伤应激相关因子,从而两者共同构成肾母细胞瘤创伤和非创伤性的蛋白标记物。在应用蛋白质组学几项重要技术基础上,包括SELDI MALDI SPE、HPLC与LC-MS的串联使用,通过对肾母细胞瘤患儿的病例血清、创伤应激患儿血清及正常小儿血清中对蛋白质定性定量比较分析,筛选并鉴定肾母细胞瘤患儿和创伤应激患儿血清中特异性高表达的蛋白质,此特异性蛋白质标记物为对前期筛选的肾母细胞瘤特异标志物的其他蛋白区分干扰及进一步验证提供了参考和意见。在前期工作中,我们付出了很大努力找出了许多相关特异性标记物,得到前期成果m／z为6438的特异性标记物,鉴定为载脂蛋白C-I,但是,由于肿瘤发生发展过程中产生的压迫周围组织或出血等创伤作用可产生一定的相关因子,同时患儿本身其他疾病及癌组织或癌旁组织能产生某些非特异或含量较少的蛋白或物质,使肿瘤患者血清中的筛查出的特异蛋白质在质和量上无法区分于某些创伤应激性患儿或良性疾病患儿。创伤应激性疾病与肾母细胞瘤病例表达的蛋白质可能存在着一定的相关性。由于炎症及创伤氧化应激对肿瘤患者血清蛋白质的质和量上的干扰,产生许许多多种类的相关蛋白质,则会使前期成果原已被鉴定为特异性蛋白标志物的可信度和应用性大大降低,因为免疫系统和体内氧化还原系统在肿瘤的发生发展过程中起着关键作用导致了有某些混杂入肾母细胞瘤血液的蛋白质同样被检测。所以本次筛选肾母细胞瘤特异性蛋白质标记物的工作中,我们将在肿瘤血清中找寻创伤应激相关的特殊蛋白或物质,与非创伤性特异标记物相鉴别并共同构建完善的指纹图谱模型。研究目的筛选并鉴定小儿肾母细胞瘤血清创伤应激相关因子,与非创伤应激性蛋白标记物相鉴别,为研究肾母细胞瘤血清早期诊断和预后监测的特异蛋白标志物的价值和前景打下基础。材料与方法1.1血清样本收集和处理本课题所选取的血清样本均来源于郑州大学第一附属医院小儿外科,包括61例肾母细胞瘤患儿(预后良好型)术前血清样本(Ⅰ stage28, Ⅱ stage18, Ⅲ stage12and IV stage3(分期依据NWTS-5标准)；34例创伤应激患儿血清样本,血清收集时间为患儿受车祸等事故创伤1-3天内；60例正常对照小儿血清来源于体检小儿。肾母细胞瘤患儿术前血清组、正常患儿血清组及创伤患儿血清组均于外周静脉全血标本清晨空腹时抽取,在4℃下静置1-2h后,3000r／min离心15min,取血清,分别编号分管分开-80。C冰箱中保存。1.2血清差异蛋白筛选SELDI-TOF：肾母细胞瘤患儿血清组和对照组血清在冰浴上缓慢融解(30-60分钟),融解后4。C离心10000rpmx5min,取5μL血清,加入10μlU9血清处理液中,4。C的条件下摇床上振荡使其充分混合(600rpmx30min):用Binding Buffer将U9处理后的血清稀释至200μl,4℃摇床上振荡使充分混合(600rpmx2min)后用于WCX2蛋白芯片上样。首先应用已知分子量的标准蛋白芯片All-in-One将SELDI质谱系统的分子量误差校正至<0.1%,再将结合好蛋白质的芯片放入质谱仪中检测。原始数据由工具Proteinchip Software3.2软件采集,激光强度设置为185,检测灵敏度设置为7,检测上限100,000M／z,优化收集数据范围2000-20000M／z。查阅文献得到的待排除因子在每组筛选差异性峰时都分别加样(加入的样品为重组的以上蛋白质),参加对比,如果差异性峰与某中带排除因子的峰值相对应,说明质荷比相同,也就说明此种差异性蛋白即为无关因子,不需要再对其进一步纯化和鉴定,将对比产生的创伤性特殊因子的有意义峰或差异峰进行鉴定。1.3数据处理1)应用工具Ciphergen Biosystems软件3.1版本对原始数据进行校正,使得总离子强度与分子量的均一化。2) Biomarker Wizard和ZUCI蛋白质芯片数据分析系统通过离散小波以去除噪音,并且减掉基线。应用局部极值的方法找寻出样本各自的峰,并且过滤出信噪比(S／N)大于2之峰。聚类分析的最小阈值设置为10%,归类样本中质荷比(M／z)差异小于0.3%之峰。3)每个M／z峰对样本区分的差异显著性有所不同。初步筛选出的M／z峰做Wilcoxon秩和检验,得出P值来衡量每峰区分各个组别的能力。4)非线性支持向量机(SVM)分类器对各个样本质谱数据进一步分析,筛选出蛋白质,找寻差异性蛋白质。所选用的SVM分类器应用径向基核函数,设置γ参数为0.6,设置罚分函数为19。1.4统计学方法将质谱原始数据经过滤噪音,经过聚类分析处理,对各个组别质谱数据芒检验。检验标选α=0.01。确定组间差异蛋白。1.5血清蛋白质分离通过固相萃取技术(SPE)按30%,50%,70%,100%有机相浓度分装,做好记录,根据亲疏水性把蛋白类别分开,后放入真空干燥仪中干燥至10ul,加入Sample Buffer5ul,煮沸15min,离心5000r/min,收集上清液。处理后的样本经过凝胶电泳分离,根据距离把分子量不同的蛋白分开,对应的分子量轴上切胶,分装至不同EP管中,经过洗涤、脱色、干燥,最后加入胰蛋白酶,酶解出目标蛋白。1.6MALDI-TOF-MS确定差异性蛋白经SPE及电泳分离的各种蛋白质与a-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid (CHCA)各取1.5ul,两者混合,置入靶板上,待干。用Cytochrome C(分子量12361.96)+CHCA和Insulin(分子量5734.51)+CHCA校样。靶板置入MALDI-TOF-MS仪器内进行检测。跟踪目标蛋白峰,确定质荷比为5816的蛋白质峰的血清样品。1.7特异蛋白质的鉴定取经酶解后的血清蛋白质液填柱上样；经液质联用质谱扫描后得到得肽质量指纹图谱,再经过Mascot检索软件在Swissprot数据库中查询比对。1.8MALDI-TOF-MS质谱数据处理及数据库检索质谱数据处理工具软件为日本岛津公司的Launchpad2.4, PMF图谱检索采用在线的Mascot检索工具得以完成。其采用小鼠源以及人源蛋白质序列作为数据库,以trypsin酶解,允许的最大漏切位点数设置为1；固定修饰是半胱氨酸碘代乙酰化；可变修饰是甲硫氨酸氧化；肽段的质量容忍度设置为±0.3Da(Monoisotopic peak)。结果l.SELDI-TOF-MS检测：肾母细胞瘤血清组和正常小儿组的质谱数据经过初步过滤筛选和统计分析后得出P值小于0.01的m／z峰15个,从差异显著蛋白质峰的任意组合中,采用SVM筛选出预测值的youden指数(阳性率与阴性率之差)最高的组合模型,筛出m／z位于5816的蛋白质峰标志物,在肾母细胞瘤组高表达(强度为2128.3±137.2),正常小儿组明显低表达(强度为30.4±7.8),差异有统计学意义(P<0.01),经交叉检测,在测试集上判别该标志物组合模型的特异性为100%,敏感度为100%。正常血清组和创伤应激血清组比较筛选到差异最显著的m／z位于5816的蛋白质标志物,.在创伤组血清中高表达(强度为3674.6±255.7),正常组中呈明显低表达(强度为30.4±7.8),差异有统计学意义(P<0.01)；肾母细胞瘤血清组和创伤应激组间差异有统计学意义(P<0.01)。2.质谱分析及数据库检索：酶解蛋白质样品后,采用LC-MS/MS测定该蛋白质的酶解肽段,将检测得到的PMF经过Mascot检索程序查询蛋白质序列数据库,查得对应可能的蛋白质为：m／z5816Da,鉴定为硫氧还蛋白(thioredoxin),所检测到的肽段氨基酸序列与数据库中的序列匹配率为20.00%。结论1、小儿肾母细胞瘤血清创伤应激相关炎症因子为硫氧还原蛋白。2、结合前期成果,与非创伤性标记物载脂蛋白C-I相鉴别,肾母细胞瘤血清中存在创伤应激相关因子,在一定程度上促进肿瘤发生发展。