论文部分内容阅读
G四联体(G4)是一种特殊的核酸二级结构,其由富含鸟嘌呤碱基(G)的寡核苷酸序列通过Hoogsteen键连接而成。在含有一些单价金属离子的溶液中,G4可与氯化血红素单体(Hemin)结合形成具有过氧化物酶活性的功能性寡核苷酸结构,又被称为 DNA 模拟酶(peroxidase-mimicking DNAzyme)。利用 DNA 模拟酶作为信号检测元件对于核酸检测具有极强的便携性,然而现今基于DNA模拟酶的核酸均相检测方式具有较大的检测背景,从而阻碍了 DNA模拟酶在核酸均相检测中的广泛应用。接合探针(junction probe,JP)源于双探针概念(binary probe,BP),在一个系统中,当且仅当两条探针同时与靶核酸序列杂交时可产生杂交信号,使其具有极强的杂交特异性,并且有潜力被运用于核酸的均相检测。传统的接合探针由于有较大的非特异性杂交概率,而使其需要经过复杂的序列设计及优化,这增加了检测的成本。本研究在前人研究的基础上,通过构建基于链置换技术(strand displacement)的接合探针,并整合G四联体用于核酸的便携检测,并初步评价其检测效能。论文主要分为以下两个章节:在第一章的研究中,我们将分裂的G-四联体形成序列整合于两个探针中。只有在含有特异性可识别剪接位点的靶基因转录本存在时,探针可相互组装形成三向接合构象,从而提供功能性的G-四联体构象,其与氯化血红素单体结合后可大大增强氯化血红素的过氧化酶活性。该系统对通过比色测定对靶基因转录本的检测限为0.063 μM,并且可特异地识别靶序列中的单碱基突变(约需3倍量的突变序列才能使检测体系获得与靶序列等同的信号)。该接合探针识别的靶序列可长达46 bp,并且无需复杂的序列设计步骤,显示出其用于进一步构建简便、高效的核酸检测系统的潜力。第二章中,我们构建了一种用于核酸靶序列识别和信号放大的方法。核酸扩增基于链置换扩增技术(strand displacement amplification,SDA),其中两条 DNA 探针在抑制链(inhibitor)作用下不相互组装触发下游链置换扩增。但在靶序列存在时,探针可通过靶序列诱导的三向接合结构形成(核心原理见第一章节)释放抑制链,随后触发SDA反应扩增富C(胞嘧啶)序列模板,这导致一系列富G(鸟嘌呤)序列生成,其与氯化血红素单体结合表现出强大的过氧化物酶活性。用TMB作为底物并将产物在450nm的波长下测定时时,其具有0.8 pM的检测限。该检测系统具有极低的检测背景以及核酸检测的高选择性。