氨氯地平和依普利酮联合应用在缓解盐敏感高血压所致肾脏损害中作用机制的研究研究背景和目的世界范围内大约10亿人正在受到高血压的困扰。临床研究表明:大约50%的高血压患者为盐敏感高血压。而盐敏感高血压正是导致心血管疾病以及肾脏功能损害的最为重要的致病因素之一。有研究表明:肾功能不全的发生与肾间质纤维化具有极为密切的关系。一些研究发现:慢性肾间质缺氧在肾间质纤维化中发挥了重要作用并最终导致肾功能不全的发生。此外,一些导致慢性肾间质缺氧的诱因也已经查明,其中最为重要的是肾小管周毛细血管损伤以及血流减少。缺氧导致的ATP耗竭,会导致肾小管上皮细胞内钙离子浓度升高以及线粒体的损伤并进而导致细胞凋亡。L型钙通道阻断剂可以显著降低由缺氧所导致的肾小管上皮细胞凋亡。此外,有人发现L型钙通道阻断剂还可以显著降低由肾脏缺血再灌注所导致的肾脏各类细胞凋亡以及由血管紧张素Ⅱ所导致的肾小管周围缺血。以上研究暗示,一些临床研究中L型钙通道阻断剂的肾脏保护作用可能是通过对肾间质缺氧的抑制而实现的。然而氨氯地平在高血压中肾脏保护作用的机制尚需进一步研究。传统认为,醛固酮通过作用于远端肾单位来调节体内电解质平衡以及血压的稳定。但是最近人们对醛固酮的认识发生了变化。越来越多的证据表明,醛固酮在心血管以及肾脏损害过程中发挥了重要的作用。在肾脏损害方面,许多研究证明:醛固酮水平的升高可以导致蛋白尿、肾小球硬化以及肾间质纤维化。亦有研究发现,在醛固酮持续灌注SD大鼠中,肾小球表达的正常足细胞标记物podocin和nephrin显著降低,然而损伤足细胞标记物desmin表达却显著升高。盐皮质激素受体(MR)阻断剂依普利酮可以显著改善由醛固酮水平升高导致的足细胞损伤以及蛋白尿。因此,足细胞损伤的治疗将具有重要临床意义。以上研究提示,MR在足细胞损伤中可能发挥了重要作用,其可能机制尚需进一步研究。并且,联合应用氨氯地平和依普利酮是否能够提供更好的肾脏保护作用尚需研究。本研究首次研究了氨氯地平和依普利酮联合应用对于高盐诱导的Dahlsalt-sensitve(DS)大鼠盐敏感血压以及肾脏损害的治疗作用。并对其可能机制进行了深入探讨。方法高盐饲料诱导的盐敏感高血压合并肾脏损害动物模型的建立6周龄Dahl salt-sensitve(DS)大鼠饲以0.4%低盐饲料或4%高盐饲料,每两周行血压测定以及24小时尿蛋白测定。至第16周龄时,相对于低盐饲料喂养DS大鼠,高盐饲料喂养DS大鼠的收缩压(SBP)超过170 mmHg并且尿蛋白超过70 mg/24h。组织学检查可见严重肾小球硬化以及肾间质纤维化。以上结果证实:高盐饲料诱导的盐敏感高血压合并肾脏损害动物模型建立成功。实验动物分组:6周龄DS大鼠40只随机分为两组:对照组(8只,LS)喂以0.4%低盐饲料(Oriental Yeast,大阪,日本),实验组(32只,HS)喂以4%高盐饲料(Oriental Yeast,大阪,日本)。8周龄时将实验组大鼠进一步随机分为4组:阳性对照组(8只,HS),氨氯地平治疗组(8只,3 mg/kg/day,HS+A),依普利酮治疗组(8只,50 mg/kg/day,HS+E)和联合用药组(8只,HS+A+E),治疗时间均为8周。整个实验过程共计10周。实验期间,每两周采用套尾法测量血压以及代谢笼采集24小时尿液各一次。血浆和肾脏标本在苯巴比妥麻醉状态下采集,其中肾脏首先行生理盐水灌注冲洗,然后切片放入10%福尔马林(pH 7.4)固定石蜡包埋用于组织学检查,或者直接放入OCT冰冻切片包埋剂制作冰冻切片用于激光捕获微分离(LCM)。剩余肾脏组织放入液氮冷冻并且放入-80℃深低温冰箱保存。1.尿液及血液生化学检查通过24小时尿蛋白和尿肌酐测定以及血肌酐测定,了解肾脏功能损害情况。通过对血浆钠离子、钾离子和醛固酮水平测定了解体内电解质代谢状况。2.组织学检查通过PAS染色对肾小球硬化的程度进行评估。通过Azan染色对肾间质纤维化进行评估。3.免疫组织化学检查通过对缺氧标记物pimonidazole免疫组织化学染色对肾间质缺氧进行检测,aminopeptidase P免疫组织化学染色来评价肾间质毛细血管密度,desmin的免疫组化染色来检测足细胞损伤。4.肾小球的激光捕获微分离和总RNA提取通过激光捕获微分离技术分离肾小球组织并提取总RNA。5.Real-time PCR通过方法4中提取的总RNA合成cDNA文库。并通过Real-time PCR检测肾小球podocin、nephrin、MR和Sgk-1表达。6.统计学分析所有数据均以(?)±SE表示。各组间统计学比较通过方差分析(ANOVA)以及多重比较的Bonferroni事后检验进行。结果1.成功建立盐敏感高血压合并肾脏损害动物模型。2.收缩压(SBP)高盐饲料喂养的DS大鼠产生了严重的高血压。并且各个治疗组降低血压的水平相近。3.24h尿蛋白,24h尿蛋白/尿肌酐比值(Urinary protein/creatinine ratio,UPCR),血浆肌酐(Plasma creatinine)以及内生肌酐清除率(Creatinine clearance,Ccr)高盐饲料喂养DS大鼠发生了24h尿蛋白和UPCR的显著增加。单一用药可以显著降低24h尿蛋白和UPCR水平。但是,联合用药组可以更好的降低24h尿蛋白和UPCR水平。高盐饲料喂养DS大鼠同样也导致了血肌酐的增加以及内生肌酐清除率的降低。只有联合用药组可以显著抑制血肌酐的增加以及内生肌酐清除率的降低。4.组织学检查低盐饲料饲养DS大鼠的肾小球以及肾间质完全正常。高盐饲料喂养导致了DS大鼠严重的肾小球硬化以及肾间质纤维化。单一应用依普利酮可以显著降低肾小球硬化。然而,与依普利酮比较而言,单一应用氨氯地平可以很好的减轻肾间质纤维化。联合用药组对肾小球硬化以及肾间质纤维化均具有很好的治疗效果。5.MR激活导致的足细胞损伤高盐饲料喂养DS大鼠肾小球podocin和nephrin表达显著降低,然而desmin表达却显著升高。该结果提示着足细胞损伤的存在。单一应用依普利酮或者联合用药可以显著改善足细胞损伤。通过进一步检测MR表达以及MR活性标志物Sgk-1我们发现,高盐饲料喂养DS大鼠可以促进MR表达水平升高。尽管依普利酮不能够降低MR的表达水平。但是,单一应用依普利酮或者联合用药可以显著降低Sgk-1的表达。6.肾间质缺氧检测高盐饲料导致了肾间质pimonidazole阳性区域显著增加。这一结果提示肾间质缺氧的存在。氨氯地平可以部分改善肾间质缺氧的情况,但是依普利酮却没有任何效果。而联合用药可以显著改善肾间质缺氧的情况。已有研究表明,肾间质缺氧与肾间质毛细血管的缺失有重要关系。本实验发现,高盐饲料喂养DS大鼠同样导致了肾间质毛细血管的缺失。氨氯地平或联合用药可以显著改善肾间质毛细血管的缺失,而依普利酮却没有任何效果。结论1.肾小球硬化以及肾间质纤维化并不一定同时发生。二者均与肾功能密切相关,任何一种损伤均可以造成24小时尿蛋白水平升高。2.肾小球硬化以及肾间质纤维化的致病因素不完全相同。MR的激活所导致的足细胞损伤在肾小球硬化的发展中发挥了重要作用。而肾间质缺氧则在肾间质纤维化中则发挥了重要作用。3.通过不同的作用机制,氨氯地平和依普利酮联合应用可以显著改善由盐敏感高血压所致的肾脏足细胞损伤以及肾间质缺氧,进而抑制肾小球硬化、肾间质纤维化为代表的肾脏损害。本研究对于指导临床慢性肾脏损害治疗具有重要指导意义。