香蕉是典型的热带、亚热带植物。低温限制香蕉的分布，影响香蕉的生长发育，使得低温胁迫成为香蕉生产最主要的环境胁迫之一，并日益成为我国香蕉产业发展的一个障碍。植物的糖代谢参与植物对低温胁迫的应答。糖不仅是植物生长发育的碳源和能源，同时糖作为信号分子也起着关键的作用。植物通过光合作用和碳代谢在“源”和“库”中产生不同的糖信号以调节生长发育和胁迫反应。此外，山梨醇作为小分子细胞相容物质，和植物的抗逆性密切相关。本研究拟克隆香蕉栽培品种“天宝蕉”（Musa spp. cv. Tianbao）叶片中若干糖代谢关键酶基因，进而利用荧光定量PCR技术进行其在低温胁迫下转录水平的相对定量表达分析，并结合低温胁迫下香蕉叶片可溶性糖含量的变化分析，以探讨香蕉叶片中糖代谢关键酶基因应答低温胁迫的分子机制及其与可溶性糖变化的关系，同时为在低温胁迫下香蕉果实中糖代谢及其关键酶基因的表达研究提供参考依据。另外，以香蕉栽培品种“天宝蕉”横切薄片（Thin cross-sections，TCSs）为材料，将S6PDH通过根癌农杆菌介导法转入香蕉，从而引入蔷薇科植物所特有的山梨醇代谢途径，为探讨山梨醇对可溶性糖的变化应答低温胁迫机制的影响奠定重要基础。主要结果如下：1香蕉叶片若干糖代谢关键酶基因的克隆采用同源克隆、RT-PCR技术和RACE法结合的方法，克隆得到了11个香蕉叶片糖代谢关键酶基因的cDNA全长及若干相关基因的cDNA部分序列：①香蕉叶片GBSSⅠ基因的cDNA全长（Ma-GBSSⅠ，GenBank登录号为HQ646360）。GBSSⅠ全长2277bp，编码一个含有616个氨基酸残基的蛋白，包含一个121bp5’ UTR，1851bp的ORF（122-1972），291bp的3’ UTR，14bp的poly (A)尾。此外，获得6个GBSSⅠ cDNA3’ RACE片段，属于GBSSⅠ基因家族3个不同成员。②香蕉叶片SSⅢ基因的cDNA全长（Ma-SSⅢ，GenBank登录号为HQ646361）。SSⅢ长3011bp，编码一个含有1002个氨基酸残基的蛋白，包含一个3009bp的ORF（3-3011），240bp的3’ UTR和17bp的poly (A)尾；此外，获得3个SSⅢ cDNA3’ RACE片段，属于SSⅢ基因家族2个不同成员。③香蕉叶片AMY基因的cDNA全长（Ma-AMY，GenBank登录号为JF682522）。AMY全长1565bp，编码一个含有416个氨基酸残基的蛋白，包含一个61bp的5′UTR、1275bp的ORF（62-1336）、214bp的3′UTR和15bp的poly (A)尾；此外，获得一个同时存在内含子驻留和外显子缺失的cDNA3’ RACE片段。④香蕉叶片BMY基因的cDNA全长（Ma-BMY，GenBank登录号为JF501023）。BMY全长1953bp，编码一个含有532个氨基酸残基的蛋白，包含一个137bp的5′UTR、1599bp的ORF（138-1736）、197bp的3′UTR和20bp的poly (A)尾；此外，还获得一个BMY cDNA3’ RACE片段。⑤香蕉叶片SPS基因的cDNA全长（Ma-SPS，GenBank登录号为HQ453990），全长3691bp，编码一个含有1082个氨基酸残基的蛋白，包含一个253bp的5′UTR、3249bp的ORF（254-3502）、173bp的3′UTR和16bp的poly (A)尾。⑥香蕉叶片SuSy基因的cDNA全长（Ma-SuSy，GenBank登录号为JF682523），全长2787bp，编码一个含有816个氨基酸残基的蛋白，包含一个85bp的5′UTR、2451bp的ORF（86-2536）、235bp的3′UTR和16bp的poly (A)尾。⑦香蕉叶片Inv基因家族的不同成员的cDNA全长：香蕉叶片Inv-V基因（Ma-Inv-V，GenBank登录号为JN417603），全长2303bp，编码一个含有645个氨基酸残基的蛋白，包含一个66bp的5′UTR、1938bp的ORF（67-2004）、282bp的3′UTR和17bp的poly (A)尾；香蕉叶片Inv-CW1（Ma-Inv-CW1，GenBank登录号为JN417601），全长2116bp，编码一个含有586个氨基酸残基的蛋白，包含一个104bp的5′UTR、1761bp的ORF（105-1865）、228bp的3′UTR和23bp的poly(A)尾；香蕉叶片Inv-CW2基因（Ma-Inv-CW2，GenBank登录号为JN417602）全长1941bp，编码一个含有583个氨基酸残基的蛋白，包含一个62bp的5′UTR、1752bp的ORF（63-1814）、109bp的3′UTR和18bp的poly (A)尾；香蕉叶片Inv-N1基因（Ma-Inv-N1，GenBank登录号为JN794581），全长2066bp，编码一个含有556个氨基酸残基的蛋白，包含一个198bp的5′UTR、1671bp的ORF（199-1869）、180bp的3′UTR和17bp的poly(A)尾；香蕉叶片Inv-N2基因（Ma-Inv-CW2，GenBank登录号为JN794582），Inv-N2全长2094bp，编码一个含有547个氨基酸残基的蛋白，包含一个283bp的5′UTR、1644bp的ORF（284-1927）、150bp的3′UTR和17bp的poly (A)尾。2香蕉叶片若干糖代谢关键酶基因的生物信息学分析在获得香蕉叶片糖代谢关键酶基因cDNA全长的基础上，采用生物信息学方法对基因编码的相应蛋白氨基酸序列进行预测分析，结果如下：①香蕉叶片GBSSⅠ为一个稳定的亲水蛋白，其氨基酸序列的N端存在叶绿体转运肽，定位于叶绿体；包含ADP结合口袋和同源二聚体界面结构域；其二级结构以无规则卷曲为主，不含卷曲螺旋；具有丰富的潜在磷酸化位点，并且以丝氨酸位点为主；含有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点等蛋白功能位点；与单子叶植物GBSSⅠ的氨基酸序列有着较高的一致度，但在进化分析中与双子叶植物GBSS进化距离较近。②香蕉叶片SSⅢ为一个不稳定的亲水蛋白，其氨基酸序列的N端存在叶绿体转运肽，定位于叶绿体；含有ADP结合口袋和同源二聚体界面保守结构域；其二级结构以无规则卷曲为主，可能具有卷曲螺旋；含有丰富的磷酸化位点，并且以丝氨酸为主；含有N-糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点和酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化等蛋白功能位点；与多种植物的SSⅢ具有较高的同源性，在进化分析中与单子叶植物进化距离较远而与双子叶植物进化距离较近。③香蕉叶片AMY为稳定的亲水蛋白，其氨基酸序列的N端存在信号肽，位于细胞外；含有AmyAc_arch_bac_plant_AmyA保守结构域和α-淀粉酶C端β折叠保守结构域；二级结构以无规则卷曲为主，不含卷曲螺旋；具有少量的磷酸化位点（17个），以酪氨酸为最多；含有蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和N-豆蔻酰化位点等功能位点；不同植物中AMY的同源性较高，在进化分析中所有单子叶植物AMY聚类在一个类群，香蕉叶片AMY与香蕉果实AMY进化距离最近。④香蕉叶片BMY为一个不稳定的亲水蛋白，其氨基酸序列的N端存在叶绿体转运肽，定位于叶绿体；属于β-淀粉酶Glycosyl hydrolase family14超级家族；二级结构以无规则卷曲为主，不含卷曲螺旋；具有丰富的潜在磷酸化位点，以丝氨酸居多；含有N-糖基化位点、cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化位点等蛋白功能位点；在不同植物中BMY的同源性较低，在进化分析中香蕉叶片BMY与香蕉果实BMY进化距离最近。⑤香蕉叶片SPS为一个不稳定的亲水蛋白，定位于细胞核的可能性最大；含有GT1_Sucrose_synthase多结构域；二级结构以无规则卷曲为主，可能含有卷曲螺旋；具有丰富的潜在磷酸化位点，并以丝氨酸为主；含有cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点等多种蛋白功能位点；SPS在不同植物中的同源性较高，在进化分析中香蕉叶片SPS与Xerophyta humilis SPS进化距离最近。⑥香蕉叶片SuSy为一个稳定的亲水蛋白，其氨基酸序列N端存在线粒体转运肽；含有GT1_Sucrose_synthase多结构域；二级结构以α螺旋为主，不含卷曲螺旋；具有丰富的潜在磷酸化位点；含有cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-糖基化位点等多种蛋白功能位点；与多种单子叶植物的同源性较高，并在进化分析中与单子叶植物聚类于一个类群。⑦香蕉叶片不同Inv蛋白家族成员的潜在磷酸化位点，均以丝氨酸为主，苏氨酸和酪氨酸为辅。但不同类型的Inv具有不同的亚细胞定位，且酸性转化酶Inv-V、Inv-CW蛋白亚家族与Inv-N蛋白亚家族在保守结构域和蛋白质二级结构的组成及三维结构上有着较大的差别，在蛋白氨基酸序列的进化上也具有明显的先后关系。不同类型的Inv可能具有各自不同的作用机制。3低温胁迫下香蕉叶片若干糖代谢关键酶基因的定量表达分析在获得香蕉叶片糖代谢关键酶基因cDNA全长的基础上，采用18S rRNA基因作为内参基因，通过实时荧光定量PCR技术分析叶片中各基因在不同低温胁迫处理下的差异表达模式，qPCR结果显示：①GBSSⅠ在不同低温条件下差异表达。GBSSⅠ的表达量在20℃处理中仅轻微上调，在13℃处理中显著上调，在4℃处理中呈下调趋势，在逐步降温处理中小幅上调表达。②SSⅢ在不同低温条件下差异表达。SSⅢ在20℃、13℃处理中均显著上调表达。在4℃处理中表达相对稳定，受持续时间的影响较小，其表达量与对照无显著差异。在逐步降温处理中小幅上调表达。③AMY的表达量在不同低温条件下无显著差异：AMY的表达量在不同低温胁迫处理中差异较小，仅在4℃处理5d后表现一个显著的下调。④BMY在低温诱导下迅速显著上调表达。在4℃处理中BMY的表达量维持着一定程度的上调，但在持续5d的上调至另一个高度。此外，逐步降温过程诱导BMY表达上调。⑤SPS在不同低温条件下差异表达。SPS的表达量在20℃、13℃处理中显著上调，在4℃条件下先轻微上调表达而后随着处理天数的增加不断下调，在逐步降温处理中小幅上调。⑥SuSy在不同低温条件下差异表达。SuSy的表达量在20℃、13℃处理中显著上调，在4℃处理前期维持着较高的表达水平，在逐步降温处理中与对照无显著差异。⑦不同类型的Inv基因在不同胁迫处理下有着不同的表达规律：Inv-V在低温胁迫下大幅上调表达；Inv-CW1的表达受到低温胁迫的抑制，而Inv-CW2在低温诱导下快速上调表达；Inv-N1的表达量随温度的降低而升高，且在4℃处理下与持续胁迫处理的天数呈正相关。而Inv-N2的表达量呈现为“上升→下降→上升→下降”的变化趋势，与Inv-N1相比，上调和下调的幅度均较小。在上述11个糖代谢关键酶基因中，Inv-N1是唯一随着温度的降低和持续时间的延长而不断上调表达的基因，表明其可能在应答低温胁迫的分子机制中起着至关重要的作用。4低温胁迫下香蕉叶片可溶性糖的变化分析采用葡萄糖绘制可溶性总糖提取的标准曲线，通过蒽酮法测定不同低温胁迫处理下香蕉叶片中可溶性糖的含量，结果显示：在20℃处理（T1）和13℃处理（T2）中，可溶性糖含量均增加了1倍，在持续不同天数的4℃低温处理（T3～T7）中，随着处理天数的增加，可溶性糖含量呈“上升→下降”的动态变化趋势，在持续2d的4℃低温处理（T4）中出现峰值（为常温下对照的4倍），而后逐渐下降，在持续5d的4℃低温处理（T7）中出现谷值（为常温下对照的2倍）。在逐步降温处理（T8）中，可溶性糖含量增加了近2倍。本研究结合不同低温下香蕉叶片糖代谢相关基因的差异表达和可溶性糖含量的动态变化的分析，为探讨可溶性糖的积累参与香蕉应答低温胁迫的分子机制奠定重要基础。在不同的低温条件下，香蕉可溶性糖积累的分子机制有较大差异。①在20℃和13℃条件下，GBSSⅠ、SSⅢ和SPS上调表达，可能导致淀粉和蔗糖含量有所增加，为可溶性糖的积累提供碳源；SuSy显著上调表达，可能在调控淀粉水平和碳的分配中起重要作用；BMY显著上调表达，暗示了淀粉分解，麦芽糖水平升高；Inv-V大幅上调表达，Inv-N2显著上调表达，导致一部分蔗糖分解产生己糖，己糖水平升高。②在4℃条件下，BMY上调表达，并在处理5d后达到一个较高值；SuSy迅速上调表达，但随着处理时间的延长其表达量逐渐下降；Inv-CW2快速上调表达，且表达水平比20℃、13℃高；Inv-N1的表达水平比20℃、13℃高，且与持续胁迫处理的天数呈正相关；Inv-V也维持着较高的表达水平；然而，GBSSⅠ、SSⅢ和SPS的表达受到一定程度的抑制，导致了淀粉和蔗糖的合成受到抑制，而且随着低温持续时间的延长，受抑制的程度越严重。可溶性糖的积累所需的碳源遭到限制，因而可溶性糖的水平随着低温处理天数的增加而降低。我们推测，4℃的延续，不仅影响到香蕉的生长发育，而且影响到香蕉的生产和果实品质，最终造成严重的寒害。③在逐步降温处理中，GBSSⅠ、SSⅢ和SPS的小幅上调表达暗示了淀粉和蔗糖含量可能有所增加，为可溶性糖的积累提供碳源。BMY的表达量达到峰值，暗示了淀粉分解，麦芽糖水平升高。Inv-V、Inv-CW2和Inv-N1维持在较高的表达水平，导致己糖水平升高。5根癌农杆菌介导的木奈S6PDH基因转入香蕉研究山梨醇是一种多元醇，为木本蔷薇科植物中主要的光合产物、同化物运输形式和可溶性的贮藏性碳水化合物。山梨醇作为小分子细胞相容物质，和植物的抗逆性密切相关。本研究以香蕉栽培品种“天宝蕉”（Musa spp. cv. Tianbao）横切薄片（Thin cross-sections，TCSs）为材料，采用根癌农杆菌介导的方法，进行木奈S6PDH基因转入香蕉的研究。结果表明，在横切薄片继代增殖培养基M4中添加5%～7%（V/V）的椰汁明显增强了香蕉芽苗的生长势；GUS基因瞬时表达检测表明，长势旺盛的香蕉芽苗（直径为7～8mm）适宜作为香蕉遗传转化的受体材料，横切薄片厚度以2mm左右为佳；采用两步法进行抗性芽的筛选得到37个抗性芽苗，生根移栽后获得31株成活苗；目的基因S6PDH和报告基因GUS的PCR检测表明其中4株是转基因植株。该研究为探讨山梨醇对香蕉可溶性糖的变化应答低温胁迫机制的影响奠定重要基础。总之，本研究采用同源克隆、RT-PCR技术和RACE法结合的方法，从香蕉栽培品种“天宝蕉”（Musa spp. cv. Tianbao）克隆得到了11个香蕉叶片糖代谢关键酶基因的cDNA全长，并对其编码的相应蛋白氨基酸序列进行生物信息分析，为研究香蕉叶片糖代谢的分子机制奠定了重要工作基础；通过实时荧光定量PCR技术对叶片中各基因在不同低温条件下差异表达模式的分析，结合可溶性糖含量的变化分析，初步揭示了可溶性糖的变化应答低温胁迫的分子机制，为提高香蕉的抗寒性提供了重要的科学依据。此外，蔷薇科植物特有的山梨醇合成关键基因S6PDH引入香蕉，为香蕉的抗性育种提供了新的可能途径。