神经节苷脂可调节神经元的分化和成熟过程,不仅对神经元的存活和脑功能的维持是小可缺少的,而且与受损伤的神纤系统的修复也具有密切的关系。单唾液酸神经节苷酯(monosialoganglioside, GM1)是一种常见的戊多糖神经节苷脂,主要分布于哺乳动物细胞的表面。在神经系统发育过程中,GM l的含量具有显著的变化。在体内和体外实验证实,GMl是具有神经营养因子(neurotrophins, NTs)样作用的一种活性物质。胰岛素样生长因子-1(Insulin-like growth factor-1. IGF-1)是一类对神经元的存活和生长有维持作用的多肽类生长因子,能有效地促进和维持神经元的生长、存活和分化,在神经元发育和神经元功能维持方面都有着重要的作用。靶组织对于支配它的神经元的存活和分化具有重要的调节作用。靶组织骨骼肌(skeletal muscle, SKM)与运动神经元之间的关系已基本被阐明,然而感觉神经元与其所支配的靶组织SKM之间的信息传递尚有待于进一步探讨。初级感觉神经元(primary sensory neuron. PSN)或初级传入神经元(primary afferent neuron. PAN)的胞体位于背根神经节(dorsal root ganglion. DRG)oDRG感觉神经元可传递由SKM肌梭传来的信息。三种酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor. Trk)(TrkA、TrkB和TrkC)在DRG感觉神经元内均有表达,TrkA、TrkB和TrkC分别是神经生长因子(nervegrowth factor,NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)或神经营养素4/5(neurotrophin4/5,NT-4/5)和神经营养素3(neurotrophin3,NT-3)的受体,不同的Trk受体亚型介导不同的神经生物学效应。GM1或IGF-1和SKM是否对DRG神经元Trk受体的表达产生影响作用目前仍不清楚。本课题用DRG神经元与SKM细胞联合培养,研究GM1或IGF-1和靶组织SKM细胞对Trk受体表达的影响作用。为了进一步研究GM1和IGF-1对不同类型的Trk受体表达的作用机制,本课题进一步用单纯培养的DRG神经元,深入研究了GM1和IGF-1对Trk受体表达影响的有关细胞信号转导通路。第一部分GM1和骨骼肌对培养的DRG神经元Trk受体表达的影响GM1是具有种经营养因子样作用的一种活性物质,靶组织SKM细胞对于感觉神经元的存活和功能的维持具有至关重要的作用。GM1和SKM是否对DRG感觉神经元Trk受体(TrkA、TrkB和TrkC)的表达产生影响作用目前仍不清楚。基于此背景,本课题设计如下实验进行此研究。利用15d(embryonic day15,E15)胚胎大鼠DRG神经元进行体外培养或E15胎鼠DRG神经元与新生大鼠SKM细胞进行联合培养。实验分组：(I)DRG神经元与SKM联合培养：只在培养液内培养,不加GM1;(2)有GM1孵育的DRG神经元与SKM联合培养：在培养液内加入10μg/mlGM1;(3)有GM l孵育的DRG神经元单纯培养：在培养液内加入10μ/mlGM1:(4)DRG神经元单纯培养(对照组)：只在培养液内培养,不加GM1。以上各组标本培养6d后,用免疫荧光双标记技术检测各种实验条件下FrkA、TrkB和TrkC(?)的表达。结果显示,GM1可使单纯分散培养的DRG神经元IrkA和TrkB的表达增加,但对TrkC的表达无显著影响；靶组织SKM可使表达TrkC的DRG神经元的比例增加,而对农达TrkA和TrkB(?)的DRG神经元的比例无显著影响；GM1和靶组织SKM联合应用可使表达IrkA、TrkB和Trk(?)的DRG神经元的比例均显著增加,表明GM1和靶组织SKM对3种Trk受体的表达具有促进作用。以上结果表明,GM1和靶组织SKM对特定Trk受体的维持起着至关重要的作用。GM1可能通过直接作用于TrkA和TrkB受体从而促进其表达。GM1未能促进TrkC受体表达表明NT-3的作用不能由GM1所代替。靶组织SKM所促进的TrkC受体的表达可能是通过神经-肌之间的信息传递来实现的。本课题的研究结果对于进一步研究GM1和靶组织SKM对Trk受体表达影响的相互作用关系研究提供了一条新的线索。第二部分GM1对培养的DRG神经元Trk受体表达影响的细胞信号转导通路研究GM1对Trk受体发挥其正常功能作用具有重要意义。本课题在第一部分研究的基础上试图探讨GM1对Trk受体影响的细胞信号转导通路。利用培养的DRG神经元进一研究细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase1/2. ERK1/2)和磷脂酰肌醇(-3)激酶(phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信号转导通路是否参与了GM I介导的特定的Trk受体的表达。胎鼠DRG神经元培养2d后,分为以下5组：(1)GM1组：DRG神经元用10μg/ml GM1继续孵育24h；(2) PD98059+GM1组：在加入10μg/ml GM1之前30min加入10μmol/L PD98059(ERK1/2(?)印制剂),继续孵育24h;(3) LY294002+GM1组：在加入10μg/ml GM I之前30min加入10μmol/L LY294002(PI3K抑制剂),继续孵育24h；(4) PD98059+LY294002+GM1组：在加入10μg/ml GM1之前30min加入10μmol/L PD98059和10μmol/L LY294002,继续孵育24h；(5)对照组：DRG神经元持续在培养液内培养。终止培养后,用实时荧光定量-PCR(real-time PCR)技术分析TrkA、TrkB和TrkC mRNA的水平,免疫印迹(Western blot)方法分析FrkA、TrkB和TrkC蛋白的水平,用免疫荧光双标技术检测TrkA、TrkB和TrkC在DRG神经元原位的表达。结果显示,GM1孵育可促进DRG神经元突起的生长,GM1可促进DRG神经元Irk A和TrkB受体及其mRNA的表达,但不能促进TrkC受体及其mRNA的表达。ERK1/2抑制剂和/或PI3K抑制剂可减弱GM1的效应。以上结果表明,GM1可促进培养的DRG神经元TrkA和TrkB受体的表达和神经突起的延长,可能是通过激活ERK1/2和/或PI3K而发挥作用的。这一研究结果对于进一步研究GM1与Trk受体的相互作用关系提供了新的实验证据。第三部分IGF-1和骨骼肌对培养的DRG神经元Trk受体表达的影响1GF-1属于多肽类生长因子并对神经元产生神经营养和神经保护作用,IGr-1是否会对DRG神经元Trk受体的表达产生影响,以及IGF-1与靶组织SKM联合应用对DRG神经元Trk受体表达的影响,目前仍不清楚。本课题利用单纯培养的DRG神经元,以及与SKM联合培养的DRG神经元,研究IGF-1和靶组织SKM对DRG神纤元1.rkA.TrkB和TrkC受体表达的影响作用。根据实验设计方案,将培养的单纯DRG神经元和与SKM联合培养的DRG神经元分为以下4组：(1)DRG神经元与SKM联合培养：只在培养液内培养,小加IGF-1；(2)有IGF-1孵育的DRG神经元与SKM联合培养：在培养液内加入20nmol/L IGF-1;(3)有IGF-1孵育的DRG神经元单纯培养：在培养液内加入20nmol/L IGF-1;(4)DRG神经元单纯培养(对照组)：只在培养液内培养,不加IGF-1。以上各组标本培养6d,用免疫荧光双标技术检测各种实验条件下TrkA、TrkB和TrkC的表达。结果显示,在没有靶组织SKM存在的情况下,IGF-1可促进DRG神经元TrkA和TrkB的表达,但对TrkC的表达影响不明显；在有靶组织SKM存在的情况下,IGF-1不但可以促进DRG神经元TrkA和TrkB的表达,而且还可促进TrkC的表达。以上结果表明,IGF-1和靶组织SKM在影响Trk受体表达方面具有密切的相互作用关系,其确切的细胞和分子机制尚有待于进一步探讨。以上研究结果对于进一步研究IGF-1和靶组织SKM对Trk受体表达影响的相互作用关系提供了一条新的研究途径：第四部分IGF-1对培养的DRG神经元Trk受体表达影响的细胞信号转导通路研究IGF-1是对神经元具有多方而作用的多肽类生长因子,具有强有力的神经营养和神经保护作用效能。IGF-1可激活ERK1/2和PI3K而产生多种神经生物学效应。IGF-1是否会通过激活这些细胞信号转导通路,从而影响TrkA.TrkB和TrkC特定的受体亚型的表达口前仍不清楚。本课题利用培养的胎鼠DRG神经元,研究1GF-1对Trk受体表达影响的细胞信号转导通路。原代培养的胎鼠DRG神经元在体外培养48h之后,分为以下5组：(1)IGF-1组：DRG神经元用20nmol/LIGF-1孵育；(2)PD98059IGF-1组：在加入20nmol/LIGF-1之前30min加入10μmol/L PD98059(ERK1/2抑制剂)孵育；(3)LY294002+IGF-1组：在加入20nmol/L IGF-1之前30min加入10μmol/LY294002(P13K抑制剂)孵育；(4)PD98059+LY294002+IGF-1组：在加入20nmol/L IGF-1之前30min加入10μmol/L PD98059和10μmol/L LY294002；(5)对照组：DRG神经元持续在培养液内培养。以上各组标本在培养箱内继续培养24h后,用real-time PCR技术分析TrkA.TrkB和TrkC mRNA的水平,用Western blot方法分析TrkA、TrkB和TrkC蛋白的水平,用免疫荧光双标技术检测TrkA、TrkB和TrkC在原位的表达。结果显示,IGF-1可促进DRG神经元突起的生长,IGF-1孵育可促进DRG神经元TrkA和TrkB受体及其mRNA的表达,但不能促进TrkC受体及其mRNA的表达。有趣的是,单独应用ERK1/2抑制剂PD98059或PI3K抑制剂LY294002对IGF-1的这些效应并没有影响,而联合应用ERK1/2抑制剂PD98059和PI3K抑制剂LY294002可阻断IGF-1的效应。以上结果表明,IGF-1促进DRG神经元突起的生长和促进DRG神经元TrkA和TrkB受体及其mRNA的表达可能是通过ERK1/2和PI3K两条细胞信号转导通路共同激活而实现的。这一研究结果表明IGF-1信号可作为潜在的靶点用于调节不同Trk受体所介导的神经生物学效应。