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为了建立能用于乳腺特异表达基因构件质量检验的山羊乳腺上皮细胞系，根据已发表的SV40病毒T基因序列设计并合成PCR引物，以整合有SV40 DNA早期基因区的COS-1细胞基因组DNA为模板，用高保真聚合酶链式反应扩增SV40T基因。凝胶电泳结果显示，扩增产物为2.5kb的单一条带，与预计大小相符。序列测定结果显示，所获序列与已发表的SV40 T基因的同源性大于99％。将PCR扩增产物克隆入剔除neo基因的真核表达载体pTarget，经XhoⅠ和NdeⅠ酶切鉴定出SV40 T基因以正确方向插入的重组表达质粒pTarget-LT。用脂质体介导法将线性化的重组表达质粒pTarget-LT转染入奶山羊原代乳腺上皮细胞，经有限稀释和反复传代后获得了转化的细胞克隆。 部分细胞克隆已在体外传30代以上，它们保持正常乳腺上皮细胞的形态特征，在胶原基质上能形成腺泡样结构，但饱和密度和生长速度明显增加。用基因组DNA进行的斑点杂交试验结果证明，转化细胞的基因组中整合有SV40 T基因。用总RNA进行的斑点杂交试验证明，转化细胞的β-酪蛋白基因能被正常转录。用自制的小鼠抗山羊β-酪蛋白免疫血清进行的酶联免疫吸附试验结果表明，转化细胞在催乳素、胰岛素和氢化可的松共同诱导下，能保持原有的分泌内源性β-酪蛋白的能力，其表达量最高达1μg/10~4个细胞。将含有LacZ报告基因的乳腺特异表达基因构件pHC-LacZ和p205CLacZ3分别转染入转化细胞，经酶组化染色试验证明，在催乳素、胰岛素和氢化可的松的诱导下，报告基因能在转化细胞中获得表达。以上试验结果表明，本研究用PCR方法从COS-1细胞基因组中克隆的SV40T基因保持其原有的细胞转化能力，转化的山羊乳腺上皮细胞能在体外长期培养和传代，符合细胞系的基本特点，不仅保持原有的分泌内源性乳蛋白的能力，而且扬州大学硕士学位论文可以用于山羊乳腺特异表达基因构件的质量检验。