猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）是引起猪圆环病毒相关疾病（Porcine circovirus-associated disease,PCVAD）的主要病原体,给全球的养猪业带来了巨大的经济损失。疫苗接种是预防和控制PCVAD的主要手段,目前PCV2疫苗主要包括灭活疫苗和亚单位疫苗,而PCV2 Cap作为这两类疫苗的主要有效成分,可自组装成病毒样颗粒（VLP）,诱导机体产生中和抗体,具有良好的抗原性。灭活疫苗由PK15细胞生产制备,但病毒滴度低、生产成本高;亚单位疫苗是用大肠杆菌或杆状病毒—昆虫细胞系统表达制备,因安全性高,受到越来越多的重视。在实际生产过程中,抗原的含量和纯度决定了疫苗的品质。PCV2亚单位疫苗面临的主要问题是抗原蛋白纯化工艺复杂且处于初级纯化水平。针对这一问题,目前急需一种快速高效的纯化方法,本研究关于PCV2 Cap蛋白的亲和肽配基展开系列实验研究,主要分为以下四个部分:1.猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的理性设计高分辨率的结构使基于靶标蛋白三维模型的计算机辅助设计成为可能。本研究借助分子对接虚拟筛选技术,构建了长度为2-9个氨基酸残基的虚拟肽库。将库中的多肽与PCV2 Cap蛋白上的特定位点实施分子对接,并通过SYBYL/MOLCAD模块分析复合物的相互作用力,然后利用一致性评分函数Cscore值对分子模拟结果进行综合评定与分析。最后,设计出67条具有特异性识别PCV2 Cap的多肽序列,为后续的PCV2 Cap蛋白纯化和新型疫苗的设计提供帮助。2.猪圆环病毒2型Cap蛋白亲和肽配基的筛选与鉴定本研究在大肠杆菌中成功表达可溶性的重组PCV2 Cap蛋白,经Ni磁珠纯化可得到高纯度且具有生物活性的PCV2 Cap蛋白,为亲和肽配基的筛选和鉴定提供了材料基础。通过ELISA定性初筛和复筛,从67条多肽序列中鉴定出13条（命名L1-L13）与PCV2 Cap蛋白反应较好的多肽,并对其进行下一步亲和性和特异性的表征。结果显示5条候选肽:L4、L7、L9、L11、L13对PCV2 Cap蛋白具有高亲和性和特异性。LSPR定量检测5条候选肽的亲和力常数KD值,结果显示L4、L7、L9、L11和L13多肽序列的KD值分别为1.23μM、1.03μM、6.71μM、103 n M和9.97μM,表明这5条候选肽与PCV2 Cap蛋白存在不同程度的亲和性结合。该研究表明基于分子对接虚拟筛选技术和体外实验验证相结合的方法,可以提高筛选多肽序列的正确率,为后续亲和吸附剂的制备提供了高亲和力多肽配基。3.亲和肽配基吸附剂的制备及纯化条件优化为了解决实际生产中PCV2 Cap纯化的难题,本章节将上一章通过体外实验筛选到的5条候选肽进行PCV2 Cap蛋白纯化的初步鉴定,并将性能较好的L11-DYWWQSWE作为最佳肽配基与NHS琼脂糖磁珠（Na MB）偶联,制备Na MB-L11亲和吸附剂。在纯化过程中,重点研究亲和吸附剂的液相条件（p H和盐离子浓度）和固相性质（配体密度）对纯化PCV2 Cap蛋白的影响,也对洗脱条件进行了优化。实验结果表明Na MB-L11亲和吸附剂的最佳纯化条件为p H 9.0、Na Cl250 mmol/L和配基密度1.25 mmol/L,其在一步纯化中得到的PCV2 Cap蛋白纯度为98%和回收率为90%。4.构建纯化自组装的PLGA-PCV2 Cap纳米颗粒新型纳米颗粒疫苗近年来取得了很大研究进展,其中高分子材料聚合物PLGA作为疫苗递送载体的研究最为关注。本实验将L11亲和肽与羧基PLGA共价偶联（PLGA-L11）,然后,加入重组PCV2 Cap蛋白上清液与其孵育结合,通过简单的重复离心,可以纯化富集到自组装的PLGA-PCV2 Cap纳米颗粒。体外研究结果表明PLGA分别在浓度为200μg/m L和100μg/m L时,对DC2.4和RAW264.7细胞无毒性,同时可以有效促进APCs对PCV2 Cap蛋白的摄取。在小鼠实验中,与溶液状态的PCV2 Cap相比,PLGA-PCV2 Cap能有效刺激机体产生更高的抗体水平,中和抗体的滴度也显著提高。这项研究提出了一种基于亲和肽的新疫苗构建策略,利用PLGA纳米颗粒可以高密度展示纯化富集到的PCV2 Cap抗原阵列,可以有效提高机体的抗体水平。