背景转移是人类癌症死亡的最常见原因,但肿瘤的转移机制仍不清楚。端粒酶是一种具有逆转录酶活性的核糖核酸酶,它能以自身RNA为模板,合成端粒重复序列,加到染色体末端,从而维持染色体结构的完整性。在人类正常体细胞中,由于决定端粒酶活性的人端粒酶逆转录酶(h TERT)低表达甚至不表达,因此大多数正常人类体细胞缺乏端粒酶活性。细胞每有丝分裂一次,染色体端粒就会丢失一部分,当体细胞染色体端粒短至一定程度时,细胞便会衰老死亡。相反,90%以上的人类恶性肿瘤中都观察到h TERT高表达和端粒酶活化。由于肿瘤细胞的端粒酶活化,细胞每分裂一次,在染色体端粒丢失的同时,端粒酶可以合成新的端粒重复序列,加至染色体末端,从而维持肿瘤细胞端粒长度的动态平衡,肿瘤细胞得以无限增殖。如果端粒酶活性或h TERT的表达被抑制,癌细胞的端粒将逐渐缩短,从而导致细胞衰老、凋亡以及致瘤性的最终丧失。端粒酶活化或h TERT基因高表达在大部分恶性肿瘤中与疾病的进展和不良预后都密切相关。以往有关端粒酶的研究主要集中于其在维持端粒的稳定和促进肿瘤细胞的生长中的作用。但近年来越来越多的研究发现h TERT同样可以促进肿瘤的侵袭和转移,课题组前期通过Meta分析发现,胃癌组织中端粒酶的活化或h TERT的表达与胃癌患者的侵袭转移密切相关,但其机制不明。因此,阐明h TERT诱导的肿瘤侵袭转移机制,将为靶向h TERT的肿瘤防治提供新的策略。目的:本课题以胃癌为研究模型,探讨h TERT介导胃癌细胞侵袭转移的作用及其分子机制。方法和材料:(1)利用蛋白质组学比较过表达h TERT前后蛋白差异变化情况;(2)通过定量PCR和Western blot(WB)对上述的差异大于5倍以上靶基因进行验证,筛选得到h TERT能够调控的靶基因(ITGB1);(3)通过Ch IP-q PCR确定h TERT与上述基因的27kb调控范围内的可能结合区域;(4)通过双萤光素酶报告基因实验进一步缩短h TERT影响的靶基因活性位点区域;(5)通过生物信息学和染色质免疫共沉淀实验Ch IP证实能直接结合到靶基因区域的两个转录因子(FOXM1和FOXO3a);(6)q PCR和Western blot检测FOXM1以及FOXO3a对ITGB1表达的影响;通过细胞粘附实验和Tranwell侵袭实验检测FOXM1和FOXO3a对胃癌细胞粘附和侵袭转移的影响;(7)通过构建不同组合的双荧光素酶报告基因质粒,鉴定出h TERT介导的靶基因上调中起主要作用的是转录因子FOXO3a;凝胶电泳迁移阻滞实验(EMSA)解析出FOXO3a的具体结合位点;(8)通过免疫荧光双标和免疫共沉淀实验检测h TERT和FOXO3a的细胞定位及蛋白-蛋白结合情况;(9)通过q PCR和Western blot检测h TERT对FOXO3a的m RNA和蛋白表达影响;(10)通过免疫共沉淀检测h TERT对FOXO3a的泛素化降解影响;(11)文献分析影响FOXO3a泛素化降解E3样连接酶,免疫荧光双标和免疫共沉淀实验检测h TERT与上述E3样连接酶共定位和蛋白相互作用情况;再次检测干扰该分子后h TERT对FOXO3a的泛素化降解情况;(12)通过小鼠尾静脉胃癌转移模型,检测h TERT在体对肿瘤细胞侵袭转移,在体内验证上述鉴定的通路;(13)通过免疫组化分析临床胃癌组织中上述通路相关分子的表达水平,检测上述蛋白表达相互之间的相关性,分析上述蛋白表达与病人临床病理特征、预后等的相关性。结果:(1)蛋白组学揭示在过表达h TERT的U2OS(h TERT阴性)细胞中,与对照组相比,差异大于5倍以上参与肿瘤侵袭转移的基因有10个:NDRG1,ITGB1,PRAF2,SIRT1,SA100A9,ATOX1,CD97,KDR,VASP,SMURF1;(2)q PCR发现上述的10个基因,过表达h TERT在三株肿瘤细胞(U2OS骨肉瘤,SGC-7901胃癌细胞和HGC-27细胞)中都促进其m RNA上调的有3个(ITGB1,PRAF2,CD97),Western blot进一步证实上述10个基因只有ITGB1在三株细胞中显著上调。干扰ITGB1的表达可明显抑制h TERT介导的肿瘤细胞粘附与转移;(3)在ITGB1的启动子区及内含子区的组蛋白修饰范围内(26644bp),通过Ch IP-q PCR初步解析出h TERT和ITGB1的转录调控区两个区域结合(一个位于启动子区,另一个位于1号内含子区);(4)构建了12个双荧光素酶报告基因质粒(内含子区6个,分别命名为p GL3-I1~I6;启动子区6个,分别命名为p GL3-P1~P6),双荧光素酶实验证实h TERT能够调控p GL3-I5和p GL3-P5的活性;(5)生物信息学预测发现,在ITGB1基因p GL3-I5区域(+9913,+10010)内有6个转录因子的可能结合位点:c-Rel,EST-1,SP1,FOXO3a,FOXP3,HNF-3b;在p GL3-P5(-1166,-1074)区域内有5个转录因子的可能结合位点:c-Rel,EST-1,HNF-3b,FOXM1,FOXP3。Ch IP实验证实FOXM1和FOXO3a可以分别和ITGB1基因的启动子区序列(-1166~-1074)和内含子区序列(+9913,+10010)结合;(6)q PCR和Western blot证实FOXM1可以促进ITGB1的m RNA和蛋白表达,而FOXO3a则能显著抑制ITGB1的m RNA和蛋白表达;细胞粘附实验和Traswell细胞侵袭实验证实FOXM1促进而FOXO3a抑制胃癌细胞的粘附和侵袭转移;(7)构建p GL3-I5和p GL3-P5的重组质粒及缺失突变质粒,双荧光素酶实验证实h TERT诱导ITGB1基因转录调控区活性上调主要通过FOXO3a反应元件(FOXM1反应元件发挥次要作用)实现。凝胶电泳迁移阻滞实验(EMSA)解析出FOXO3a与ITGB1基因的内含子区F3BE(CAGAGCATTTGTATTTTGTCTACTA)结合;(8)免疫荧光和免疫共沉淀实验发现h TERT和FOXO3a细胞内共定位并存在蛋白-蛋白相互作用;(9)q PCR证实h TERT对FOXO3a的m RNA无影响,Western blot证实h TERT抑制了FOXO3a蛋白的表达;(10)免疫共沉淀证实h TERT能促进FOXO3a的泛素化降解;(11)文献报道MDM2和β-TRCP能够作为FOXO3a的泛素化降解的E3样连接酶;生物信息学提示两者都能和h TERT相互作用;免疫共沉淀实验证实只有MDM2可以和h TERT相互作用;免疫荧光双标进一步证实h TERT和MDM2在细胞内共定位,且过表达h TERT能够促进MDM2和FOXO3a的结合;沉默MDM2能逆转h TERT介导的对FOXO3a泛素化降解以及细胞的粘附和肿瘤侵袭转移;(12)在小鼠尾静脉胃癌转移模型中,h TERT能显著促进胃癌细胞的侵袭转移;免疫荧光染色和免疫组化染色证实h TERT在体水平抑制FOXO3a的表达并促进ITGB1表达;(13)在胃癌组织标本中,h TERT与FOXO3a的表达负相关、与ITGB1的表达正相关。高表达h TERT或ITGB1或者低表达FOXO3a均提示胃癌患者的预后差,联合上述指标对病人生存时间的预测明显优于单个指标。结论:“h TERT/MDM2-FOXO3a-ITGB1”通路是h TERT促进胃癌细胞侵袭转移的分子机制,靶向该通路可能作为预防肿瘤转移的新策略。背景介绍:在第一部分实验中,我们已经清楚的证实,FOXO3a/FOXM1作为FOX家族的重要成员,均参与了h TERT所介导的ITGB1上调及胃癌细胞粘附、侵袭和转移,且FOXO3a发挥主要作用。本课题组前期工作表明,FOXM1在细胞周期进程的调控中发挥重要作用,核受体特异性激动剂GW3965活化肝X受体(LXR)后,能够抑制FOXM1的表达从而抑制肿瘤细胞的增殖(Hu C,et al.Oncogene.2014 29;33(22):2888-97.)。FOXM1是一类具有保守的DNA结合域(也称翼状螺旋的DNA结合域)的超家族成员之一,该转录因子在多种细胞肿瘤中都高表达。肿瘤转移能力与肿瘤组织中该分子的表达水平正相关[10,11]。近年的研究还表明,FOXM1的表达水平与肿瘤细胞对化疗药物的敏感性密切相关。在胰腺癌中高FOXM1表达的患者对化疗药物相对不敏感,沉默FOXM1后能够通过诱导肿瘤细胞凋亡增敏化疗药物,提示FOXM1和细胞凋亡之存在一定关系,然而详细的机制尚不清楚。在胃癌细胞中,FOXM1是否影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性尚不清楚。奥沙利铂作为第三代铂类化疗药,已经被当作一线化疗药广泛应用于胃癌晚期病人中。然而,有的患者对其并不十分敏感,其原因可能包括mi RNA的异常表达、幽门螺杆菌感染、致癌基因的激活,转录因子表达异常等。在这些可能的机制中,抗凋亡蛋白的过表达是重要的原因之一。髓细胞白血病因子-1(Mcl-1)属于Bcl-2抗凋亡蛋白家族成员之一。Mcl-1能够与促凋亡蛋白,诸如Bim,Noxa和Bak等相互作用后,从而稳定线粒体膜并防止细胞凋亡。Mcl-1也能够促进ATP生成、线粒体融合从而发挥抗凋亡作用。作为一种重要的抗凋亡蛋白和肿瘤治疗的靶标,Mcl-1的转录调控研究十分重要。据报道,Mcl-1在胃癌患者中高表达,沉默Mcl-1能增敏胃癌细胞对化疗药物的敏感性。Mcl-1的表达水平也与胃癌患者的预后密切相关。因此,阐明Mcl-1的转录调控机制将有益于化疗的肿瘤患者。尽管FOXM1和Mcl-1都与肿瘤患者的化疗敏感性和预后相关,在胃癌患者中,FOXM1是否参与胃癌细胞对化疗药物反应性、FOXM1能否调控Mcl-1表达和从而介导肿瘤细胞对奥沙利铂敏感性仍然未知。目的:探讨FOXM1是否影响胃癌细胞对化疗药物的敏感性、以及FOXM1与胃癌细胞化疗敏感性的具体分子机制。方法和材料:(1)免疫组化染色和实时定量PCR技术分别在人胃癌标本和相应的癌旁组织中检测FOXM1及Mcl-1的蛋白和m RNA的表达;(2)在BGC-823细胞(高FOXM1表达)中干扰FOXM1、在MKN-45(低FOXM1表达)中过表达FOXM1后实时定量PCR技术和Western blot检测Mcl-1的m RNA和蛋白表达;(3)采用生物信息学预测Mcl-1基因启动子区域潜在的FOXM1结合位点,并进一步采用双荧光素酶报告基因实验检测FOXM1对Mcl-1基因启动子转录活性的影响;(4)通过凝胶电泳迁移阻滞实验(EMSA)和T7 TNT快速转录耦联翻译系统检测FOXM1蛋白和Mcl-1基因5’调控区的特异性探针之间的相互作用。此外,采用染色质免疫沉(Ch IP)检测FOXM1与Mcl-1基因启动子区的结合情况;(5)在BGC-823细胞中干扰FOXM1-Mcl-1通路以及在MKN-45细胞中回复FOXM1-Mcl-1通路后,通过CCK-8实验检测胃癌细胞在奥沙利铂处理后的细胞增殖情况;(6)在BGC-823细胞中干扰FOXM1-Mcl-1通路以及在MKN-45细胞中回复FOXM1-Mcl-1通路后,Annexin V–FITC/PI和cleaved PARP检测细胞凋亡变化。结果:(1)FOXM1和Mcl-1表达水平在人胃癌标本呈正相关;(2)FOXM1和Mcl-1均与预后不良有关;(3)在MKN45细胞中过表达FOXM1促进Mcl-1的表达,BGC-823细胞中沉默FOXM1抑制了Mcl-1表达;(4)在MKN45细胞中,过表达FOXM1上调Mcl-1基因启动子的转录活性,而在BGC-823细胞中沉默FOXM1表达抑制Mcl-1的启动子活性;(5)FOXM1直接与Mcl-1启动子区的(-635acaaacaa-628)结合。此外,过表达FOXM1能增加FOXM1和Mcl-1启动子区域之间的结合,而沉默FOXM1抑制FOXM1和Mcl-1启动子结合;(6)过表达FOXM1能减少奥沙利铂引起的细胞凋亡,沉默Mcl-1部分增加FOXM1减少的凋亡;(7)抑制FOXM1增加了奥沙利铂引起的细胞凋亡,过表达Mcl-1能部分逆转该效应。结论(1)Mcl-1是FOXM1的一个新靶基因;(2)FOXM1通过直接调控抗凋亡蛋白Mcl-1的转录进而介导胃癌细胞对奥沙利铂的敏感性;(3)靶向FOXM1/Mcl-1通路可能作为增强胃癌对奥沙利铂敏感性的新策略。