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牛病毒性腹泻病毒（Bovine viral diarrhea virus,BVDV）是引起牛呼吸道综合征、繁殖障碍性疾病、腹泻/黏膜病、免疫抑制和持续性感染的重要病原,给全球养牛业造成了巨大的损失。PCR检测技术是目前检测BVDV的主流手段。尽管目前已建立的BVDV PCR检测方法很多,但未见适用于临床现场检测BVDV的PCR检测方法及试剂盒,制约了BVDV的快速诊断和检疫。本研究的目的是基于恒温隔绝式荧光RT-PCR（Insulated isothermal RT-PCR,ii RT-PCR）技术,研制检测BVDV1型的试剂盒,并应用试剂盒进行BVDV1型现场诊断及流行病学调查。并取得了以下成果:1.BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测试剂盒研制及应用为了研制能现场检测BVDV1型的荧光RT-PCR检测试剂盒,对GenBank中下载的54条BVDV1型、43条BVDV2型、11条BVDV3型5’UTR序列进行分析后,设计了特异性检测BVDV1型的引物:BVDV1 iiF:5’-AAGCC-TCGAGATGCCACG-3’,BVDV1 iiR:5’-GCAGCACCCTATCAGGCTGT-3’;探针:BVDV1 iiPb:5’-FAM-CCCACAGCACATC-TTAA-MGB-3’。通过体系优化,建立了BVDV1型恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法。该方法稳定性好、特异性好,对BVDV1型参考毒株、BVDV1a、BVDV1b、BVDV1c、BVDV1d均能检出,对无关病原未检出;检测下限为52.7 copies·μL-1,灵敏度高。与SNT1905-2007推荐的RT-PCR方法和两种文献报道的荧光定量RT-PCR方法同时对60份腹泻粪便样本和60份血清样本进行BVDV1型的检测,结果表明本方法均优于其他三种方法。将该方法优化的反应体系试剂进行定量分装、冻干处理后与阳性质粒模板、回溶Buffer共同组装成为50μL体系检测试剂盒,可满足一个50μL体系或两个25μL体系的使用,减少了加样的环节,节约了反应时间,减少了操作过程中的污染,并具有可常温保存和运输的优势。配合PetNAD核酸提取试剂盒和POCKIT?手持式核酸分析仪,实现了BVDV1型的现场诊断,从核酸提取到出检测结果仅需1 h。采用本实验研制的BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒对阿坝藏族羌族自治州若尔盖县热尔乡和红原县安曲镇两个牧场爆发以腹泻为特征的疾病进行现场检测诊断,均检出有BVDV1型的感染;对来自于我国9个省/市区的29份商品化牛冻精样本和20162017年来自4个品牌的20份胎牛血清样本进行检测,其BVDV1型的检出率分别为34.48%和75%,表明四川省市场流通的商品化牛冻精和胎牛血清中BVDV1型的携带率较高。2.川西北草原牦牛BVDV的病原流行病学调查川西北草原是我国牦牛养殖的主要区域之一,犊牛腹泻是该区域的常见病和多发病。为了调查川西北草原牦牛腹泻样本和麦洼牦牛核心种群中BVDV1型的流行情况,采集了20152017年川西北草原25个牧场的448份牦牛腹泻样本和麦洼牦牛核心种群3个牧场的627份血清样本,采用研制的BVDV1型iiRT-PCR检测试剂盒进行BVDV1型病原流行病学调查,及BVDV1型与牛轮状病毒（bovine rotavirus,BRV）、牛冠状病毒（bovine coronavirus,BCoV）的混合感染情况调查。调查结果显示:20152017年牦牛腹泻样本中BVDV1型平均检出率为29.01%;2015年、2016年、2017年的BVDV1型检出率分别为27.47%、30%、29.11%。对检出的130份BVDV1型阳性样本进行BRV、BCoV的混合感染情况的调查,结果显示BVDV1型与BRV、BCoV的混合感染率分别90%、75.38%。本实验结果表明川西北草原BVDV1型、BRV、BCoV的混感染情况严重,为川西北草原牦牛腹泻病的防控提供了科学依据。