论文部分内容阅读
目的:绒毛膜癌,简称绒癌（choriocarcinoma,CC）,是妊娠滋养细胞肿瘤（gestational trophoblastic neoplasia,GTN）的一种,恶性程度极高,可继发于葡萄胎妊娠、流产、足月妊娠、异位妊娠,其特点是滋养细胞失去了原有的绒毛结构,而散在地侵入肌层,发生局部转移,生长迅速,早期即可通过血液转移至肺、脑等重要器官。因其对化疗药物极其敏感,使大部分患者能够通过化疗治愈,但耐药性的产生严重影响着我们攻克绒毛膜癌的进程。本文对上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）在绒癌转移机制进行研究。上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是指某些特定部位的上皮细胞所发生的形态学特征的改变,使其在生物学上更适合侵袭和转移,近年来大量实验证明上皮-间质转化参与多种上皮恶性肿瘤的发生与发展。而Slug作为锌指转录因子家族成员之一,是EMT重要的调节因子,通过与E-cadherin的E-box结合抑制其细胞内转录,导致细胞间紧密连接遭到破坏,从而诱导上皮-间质转化的发生,本实验通过将Slug基因转染人绒毛膜癌JEG-3细胞,使其在细胞中过表达,观察转染后的细胞增殖能力及上皮-间质转化相关标记物的E-cadherin、N-cadherin的表达水平,阐述绒癌的发生发展机制,为绒癌的治疗提供理论依据。方法:1 细胞培养:人绒毛膜癌JEG-3细胞株,在温度为37℃,CO2浓度为5%的恒温培养箱中培养;2 实验分组:①实验组,转染pEGFP-N1-Slug质粒;②阴性对照组,转染不含目的基因的空白质粒;③脂质体对照组,转染时加入LipofectamineTM2000脂质体转染试剂;④空白对照组,常规培养,无转染处理;3 显微镜观察各个实验组转染后细胞形态的变化;4 CCK-8法检测实验组、阴性对照组、脂质体对照组、空白对照组在0h、24h、48h、72h、96h时的增殖情况;5 Realtime-PCR检测实验组、阴性对照组、脂质体对照组、空白对照组细胞转染48小时后,细胞中Slug-mRNA的表达水平;6 Western blot检测各组细胞转染48小时后细胞中E-cadherin及N-cadherin表达情况7 数据统计分析,本实验数据使用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析,实验数据以均数±标准差（±s）表示。统计前对数据进行正态性及方差齐性检验,对于正态、方差齐的多组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA）,组间差异采用LSD/SNK法。检验水准α=0.05,P<0.05表示差异有统计学意义,P>0.05差异无统计学意义。结果:1 人绒毛膜细胞JEG-3细胞形态的观察显微镜下观察各组细胞形态,空白对照组、脂质体对照组、阴性对照组细胞呈圆形或椭圆形,胞膜完整,呈片状生长;转染后的细胞形态不规则,呈梭形或多角形,细胞排列松散。2 转染效率的观察使用LipofectamineTM2000脂质体转染法转染JEG-3细胞,荧光显微镜观察细胞转染效率。实验组及阴性对照组在转染24及48小时后后转染效率分别为15-20%、70-80%。脂质体对照组及空白对照组无荧光表达。3 CCK-8法检测细胞增殖情况0小时:实验组0.142±0.007,阴性对照组0.138±0.003,脂质体对照组0.143±0.003,空白对照组0.139±0.002,各组间比较P>0.05,差异无统计学意义,各组增殖速度无差异;24小时:实验组0.247±0.004,阴性对照组0.244±0.007,脂质体对照组0.193±0.004,空白对照组0.221±0.010,实验组与阴性对照组相比,P>0.05,差异无统计学意义,实验组与另外两个对照组（脂质体、空白对照组）相比,P<0.05,差异有统计学意义,说明实验组增殖速率较空白对照组、脂质体对照组快;48小时:实验组0.509±0.004,阴性对照组0.417±0.003,脂质体对照组0.407±0.011,空白对照组0.418±0.009,实验组与其他三组相比P<0.05,差异有统计学意义,实验组增殖速率较其他三组快;72小时:实验组0.977±0.019,阴性对照组0.617±0.003,脂质体对照组0.515±0.013,空白对照组0.781±0.016,实验组与阴性对照组、脂质体对照组、空白对照组三组相比P<0.05,差异有统计学意义,说明转染后72小时实验组增殖速率较其他三组快;96小时:实验组1.371±0.023,阴性对照组1.163±0.006,脂质体对照组0.801±0.005,空白对照组1.293±0.003,实验组与其他三组相比P<0.05,差异有统计学意义,实验组增殖速率较其他三组快。4 Realtime-qPCR检测实验组及各对照组细胞转染48小时后,Slug-mRNA的表达水平:实验组2.070±0.028,阴性对照组1.093±0.011,脂质体对照组1.055±0.025,空白对照组1.002±0.021,实验组与阴性对照组、脂质体对照组、空白对照组三组相比P<0.05,差异有统计学意义,说明转染后实验组Slug-m RNA的表达量较其他三组升高,实现了目的基因的高表达。5 Western blot检测各组细胞转染48小时后细胞中E-cadherin及N-cadherin表达情况:各组E蛋白表达水平:实验组为0.302±0.016,阴性对照组为0.645±0.020,脂质体对照组为0.594±0.031,空白对照组为0.390±0.034,实验组E-cadherin的表达水平较阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组明显下调,P<0.05,差异有统计学意义。各组N-cadherin的表达水平:实验组为0.672±0.037,阴性对照组为0.578±0.030,脂质体对照组为0.576±0.013,空白对照组为0.581±0.020。实验组N-cadherin的表达水平较阴性对照组、脂质体对照组和空白对照组明显上调,P<0.05,差异有统计学意义。结论:1 Slug基因的高表达能够改变绒癌JEG-3细胞学形态,使其更符合间质细胞的形态特征,从而使其恶性侵袭力增强。2 Slug基因的高表达能够提高绒癌JEG-3细胞的增殖速率,从而加速其临床进程。3 Slug基因的高表达能够使绒癌JEG-3细胞E-cadherin表达水平下降,N-cadherin表达水平上升,说明Slug基因参与绒癌JEG-3细胞的上皮-间质转化过程,从而影响绒癌的发生与发展。