心肌肥厚和心衰常常伴发心律失常，特别是心衰时心源性猝死的发生率大大提高，揭示此心律失常发生的电生理机制，开发有效的抗心律失常药物是心血管研究领域的重要课题。研究显示，肥厚心肌细胞最突出的电生理改变是复极化过程延迟致动作电位的延长。已在不同原因所致的多种实验动物心肌肥厚、心衰模型及心衰的人心室细胞上观察到瞬时外向钾电流Ito的减小，Ito是主要的早期复极化电流，它的密度减低将使动作电位时程延长。 在压力负荷导致的心肌肥厚中有多种神经体液因素参与，其中AngⅡ是重要的体液因子，大量的实验证明，AngⅡ在诱导心肌组织肥厚性重构中起关键作用。有实验显示，AngⅡ可抑制Kv4.3通道蛋白的表达，减少心肌钾电流，AngⅡ还可上调L型钙通道，使钙离子内流增加，故推测AngⅡ对心肌动作电位的延长亦起重要作用。但AngⅡ对心肌细胞离子通道的调节机制尚不清楚。 本实验拟在培养的新生大鼠心肌细胞观察AngⅡ在诱导细胞肥厚过程中对Kv4.2(为鼠类Ito的主要通道蛋白)表达的影响及钙离子在其细胞内信号传导通路中的作用，为阐明病理情况下心肌电生理重构机制提供实验依据。 一.新生大鼠心肌细胞的原代培养及鉴定 目的：建立改良的大鼠乳鼠心肌细胞原代培养技术。 方法：取新生72小时内的SD仔鼠，消毒，开胸，夹取心室部分，于D-Hanks液中洗涤，剪碎。消化3-4次后，离心，收集细胞，用培养液混悬，过滤，差速贴壁1小时后，收集培养液中的非贴壁细胞，细胞计数，细胞密度调至5×105个/ml，种于铺有圆盖玻片的24孔板中，1天后换培养基，然后每隔2天更换培养基1次。台盼蓝法测定细胞存活率。倒置相差显微镜下动态观察心肌细胞形态学变化后于共聚焦显微镜下照像。免疫细胞化学技术鉴定心肌细胞。 结论：本实验成功建立了快速，稳定，可重复性好的大鼠原代心肌细胞培养方法，为后续实验打下良好基础。 二.血管紧张素Ⅱ在诱导心肌细胞肥厚过程中细胞内钙和Kv4.2表达的变化 目的：建立血管紧张素致心肌细胞肥大模型及研究血管紧张素Ⅱ对Kv4.2表达的影响及可能的细胞内机制。 方法： 1.心肌细胞肥大模型的建立(1)心肌细胞的分离及原代培养方法同上，将细胞种于24孔培养板中，分两组，每组六孔，五个时间点共10组。用含有15％的DMEM培养基培养细胞两天后换为无血清培养基，培养24小时后加入AngⅡ(1μmol/L)，继续培养24，48，72，96，120小时。在此期间，每隔48小时换一次液，每隔24小时加入相同剂量的AngⅡ。(2)在24，48，72，96，120小时五个时间点分别提取每孔内的细胞蛋白。用BCA试剂盒进行蛋白定量。取培养板，用D-HANKS液洗培养基两次，每孔加入0.25％胰酶和0.02％EDTA的混合液。在37度下消化3-5分钟，镜下观察，细胞回缩，间隙变大，变圆，立即加入含血清的培养基终止消化，用弯头吸管按顺序吹遍，吹下来的细胞移入离心管，离心后用0.01MPBS洗，每次5min，洗三次后。加入细胞裂解液，蛋白酶抑制剂，冰上裂解半小时，后于4度离心(12000rpm)半小时。将上清置于另一离心管中，用BCA试剂盒进行蛋白定量。 2.血管紧张素Ⅱ对心肌细胞胞浆钙离子浓度的影响将处理过的24孔培养板置于超净工作台上，紫外灯照射30分钟，从75％酒精中取出预先泡过的小盖玻片，在酒精灯上烤干，置于24孔培养板中，用多聚赖氨酸在每个孔中反复铺敷4-6遍，多余的多聚赖氨酸吸出，鼓风吹干，紫外线照射过夜。心肌细胞分离后，将细胞悬液接种于上述小圆玻片上，接种密度为1×105/ml。换液及AngⅡ给药方法同上，在24，48，72，96，120小时五个时间点取心肌细胞，在37度避光条件下，用Fluo-3/AM(10μmol/L)负载30min，DMEM溶液漂洗2次，400μlDMEM溶液保护，分别用激光共聚焦显微镜检测细胞内钙荧光强度，以同批培养的未加AngⅡ的心肌细胞做空白对照。 3.血管紧张素Ⅱ在诱导心肌细胞肥厚过程中Kv4.2表达的变化。(1)模型制备心肌细胞的分离及原代培养方法同上，将细胞以2×106个/ml种于50ml培养瓶中，分两组，每组四瓶，两个时间点共4组。用含有15％的DMEM培养基培养细胞两天后换为无血清培养基，培养一天后加入AngⅡ(1μmol/L)，继续培养48，96小时。在此期间，每隔48小时换一次液，每隔24小时加入相同剂量的AngⅡ。空白对照组不加AngⅡ，其余处理同血管紧张素Ⅱ组。(2)流式细胞样品的制备及检测在48，96小时两个时间点分别消化每瓶内的心肌细胞，制备流式细胞样品。取培养瓶，弃去培养基，再用D-HANKS液洗两次，然后每孔加入0.25％胰酶和0.02％EDTA的混合液。在37度下消化3-5分钟，镜下观察，细胞回缩，间隙变大，变圆，立即加入含血清的培养基终止消化，用弯头吸管按顺序吹遍，吹下来的细胞移入离心管，离心(1000rpm)后用0.01MPBS洗，每次5min，洗三次后，悬浮，并调整细胞密度为1×106个/ml，加入anti-Kv4.2的一抗(1：100稀释)，于37度下孵育半小时，离心(1000rpm)用0.01MPBS洗，每次5min，洗两次，洗去多余的一抗，然后加入PE标记的二抗，半小时后使用流式细胞仪检测。 结论： 1.血管紧张素Ⅱ能够作为一种独立因素诱导心肌细胞肥大，给药48小时为细胞肥大早期，给药96小时为细胞肥大明显期。伴随细胞肥大过程中，细胞内游离钙离子浓度呈平行变化。 2.血管紧张素Ⅱ在心肌细胞肥大早期不能下调Kv4.2，而在心肌细胞肥大明显期，则能显著下调Kv4.2。3血管紧张素Ⅱ在诱导心肌细胞肥大过程中，可能通过细胞内钙离子以外的信号通路下调Ito通道蛋白Kv4.2。