功能核酸用于环境及活细胞内金属离子的传感与成像研究

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金属元素在整个生命体系中有双重作用,一方面能维持动植物的生命活动,另一方面也可能危害其健康。因此,研究环境中及生物体内的金属离子含量与分布,并对其进行有效地检测,对于保护环境与人类健康有积极意义。功能核酸是指具有特定生物功能,一般指能高特异性结合特定目标物或具有某些催化功能的核酸分子。功能核酸探针在传感方面具有一些独特的优势:功能核酸可以通过指数富集配体系统进化法(SELEX)筛选获得,理论上任何目标物均可筛到其对应的功能核酸;已经筛到的功能核酸可以通过合成获得,适用于大批量生产;一些功能核酸,如左旋核酸(L-DNA)在生理环境下更稳定,抗酶切降解效果更好,为活体金属离子检测提供了可行性;最后,功能核酸可以经历多次变性复性而不改变其活性,更易保存,减少了设备消耗。更重要的是,一些功能核酸对金属离子表现出高度特异性,且响应信号与金属离子含量相关,这为简单、方便、有效地检测金属离子提供了可能性。因此,利用功能核酸的优点,我们设计了一系列的生物传感器用于检测环境和生物体内金属离子。在第二章中,我们构建了一种基于钾离子传感寡核苷酸(Potassium Sensing Oligonucleotide,简称PSO)的生物传感器。首先用修饰有荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,简称FRET)报告基团对的DNA链来优化PSO的终端,以获取更高的灵敏度,然后用DNA合成仪将二酰基脂质组装到PSO链上。在有钾离子出现时,形成的G-四聚体构型会使产生FRET效应的两种荧光基团(FAM和TAMRA)对靠近,从而导致FRET效率发生改变。此外,随着K+浓度的变化,荧光强度比率也是可逆的。基于这个实验方案,我们在细胞膜上组装了该传感器,并第一次将其用于实时检测细胞微环境中K+浓度的动态变化。在第三章中,我们构造了一种在均相溶液和活性细胞中的L型凝血酶结合适配体(L-type Thrombin Binding Aptame,简称L-TBA)K+传感器,通过用可预测的L-TBA的优点,演示基于L-TBA的K+传感器克服了天然D-PSO的缺陷,从而在活性细胞内实现K+成像并且表现出精确,安全和生物正交PSO的优点。在第四章中,我们基于Pb2+ DNAzymes,采用已报到的D-DNAzyme序列,根据L-DNAzyme与D-DNAzyme在存在非手性金属离子辅因子时有类似的催化活性,但在生物样品中,L-DNAzyme还有额外的生物稳定性的优点,设计了L-DNAzyme识别单元的生物传感器并将其用在环境水体检测,如湘江水,和复杂生物环境中,如胎牛血清(Fetal bovine serum,简称FBS),来检测Pb2+。目前,已筛选出的特异性识别各种离子的DNAzymes,很可能为针对灵敏性和选择性而发展的检测各种目标物的新的基于L-DNAzyme的传感系统在生物医学和环境检测领域提供更深一步的应用。
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