目的:通过网络药理学研究方法,将药物靶标预测、网络分析和实验验证相结合,探讨乌头汤缓解类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)寒证的网络调节机制。方法:1.数据收集与整理1.1乌头汤所含化学成分收集和整理:基于台湾中医药数据库(TCM Database@Taiwan)收集已知的乌头汤五味中药所含的化学成分;1.2已知RA相关基因收集和整理:基于DrugBank数据库、OMIM数据库、GAD数据库和KEGG通路数据库,收集已知RA相关基因;1.3蛋白质相互作用数据收集和整理:蛋白质相互作用信息来源于八个现有的蛋白质相互作用数据库,分别为Human Annotated and Predicted Protein Interaction Database(HAPPI)、Reactome、Online Predicted Human Interaction Database(OPHID)、InAct、Human Protein Reference Database(HPRD)、Molecular interaction Database(MINT)、Database of Interacting Proteins(DIP)和PDZBase。2.乌头汤候选靶标预测:采用drug-CIPHER-CS软件,基于化合物结构相似性和功能相似性原理,预测乌头汤所含化学成分的候选靶标基因。3.乌头汤所含化学成分-预测靶标基因-已知RA相关基因相互作用网络的构建与分析3.1基于现有蛋白质相互作用信息,提取乌头汤候选靶标基因与已知RA相关基因间已知RA相关基因的相互作用信息,并构建药物靶标分子网络;3.2网络拓扑特征值的计算:计算四种网络拓扑特征值节点连接度、介度、紧密度和K-core值,并选取其值大于相应中位数的节点为关键hub节点。4.通路富集分析:基于Biocarta数据库,利用DAVID分析平台,进行生物分子功能和通路的富集分析。结合前期乌头汤药效动力学和尿代谢组学,以及通路功能调研,设计整体和细胞多层次实验验证。5.整体实验5.1胶原诱导性关节炎模型的建立5.1.1 CIA(胶原诱导性关节炎,Collagen-induced arthritis,CIA)关节炎模型的建立:按2mg·mL-1将牛Ⅱ型胶原加入0.1mol·L-1冰醋酸溶液中,4℃过夜。临用前加入等体积不完全弗氏佐剂,用组织匀浆机充分乳化,以滴入水中呈珠状为度,得到终浓度为1mg·mL-1的胶原乳剂,即配即用。于雄性SD大鼠(斯泼累格·多雷大鼠,Sprague-DawleyRat,SD大鼠)尾根部2~3cm处皮内注射胶原乳化剂,第7天(D7)激活免疫;5.1.2 CIA寒/热性关节炎模型的建立:在复制CIA模型的同时,模拟类风湿性关节炎致病原因,分别施加外界风寒湿(风速6 m/s,相对湿度均为60%,温度为6℃,连续21天)、风湿热(风速6 m/s,相对湿度均为90%,温度为37℃,连续21天)条件刺激,造成CIA寒性和CIA热性模型。5.2实验动物分组和给药:雄性SD大鼠60只,随机分为10个组,每组6只,组别如下:正常组、CIA模型组、CIA寒性模型组、CIA寒性模型组+乌头汤(低、中、高治疗剂量组)、CIA热性模型组、CIA热性模型组+乌头汤(低、中、高治疗剂量组)。其中,乌头汤低、中、高治疗剂量组的浓度1.88,3.75,7.5 g/kg,分别相当于0.5倍、1倍、2倍临床剂量和临床等倍剂量。大鼠给药容积按照1mL/100g体重灌胃,从免疫当天开始给药,乌头汤每给药6天,间歇1天。给药至免疫第22天,同时,正常对照组和模型组灌服等容积蒸馏水。造模后第23天进行动物取材。5.3关节炎评价5.3.1疾病严重度指标评价:观察并记录各组大鼠的疾病严重情况(疾病发生率、关节炎临床评分、受累关节比例和首次发病时间)。疾病发生率:每组中发病大鼠的只数/大鼠总只数的比例;关节炎临床评分:自免疫8天开始,参考文献每2～3天进行一次临床积分(双人目测),计算出临床积分,每足20分制,共80分;受累关节比例:每组中受累关节的只数/总关节只数的比例;首次发病时间:每日观察各组大鼠发病情况,并记录开始发病时间。采用Elisa(酶联免疫吸附试验,Enzyme-linked immunoabsorbent assay,Elisa)法检测各组动物血清IgG和IgM的表达量;5.3.2病证结合指标评价:观察并记录各组大鼠的病证结合指标情况(关节表面温度和血流量)。从发病第一天开始,通过红外热像仪测量雄性SD大鼠左足的关节表面温度,每天测量一次。在免疫第22天,通过激光多普勒血流仪测量雄性SD大鼠左足的血流量。6.体外细胞实验6.1细胞培养:HFLS-RA(人成纤维滑膜细胞,Human Fibroblast like Synoviocytes,HFLS-RA)按常规培养于含2 mM谷氨酰胺、100 U/mL青霉素、80 U/mL 链霉素、10%FBS(胎牛血清,Fetal calf serum,FBS)及 10%生长因子的滑膜细胞专用培养基中,置37℃、5%C02、饱和湿度培养箱内培养;6.2细胞诱导及药物干预:在体外实验验证中,HFLS-RA的代数均4代到8代,通过 10 ng/mL 的 IL-1β(白介素-1β,Interleukin-1β,IL-1β)诱导后,由不同浓度的乌头汤(0.1,0.2和0.4 μ g/mL)作用24小时,再进行体外验证。7.相关蛋白表达水平检测:采用Western blot法检测各组动物关节软骨中和体外培养HFLS-RA中的NCOA1(核受体辅助活化因子1,Nuclear receptor coactivator 1,NCOA1)、NCOA2(核受体辅助活化因子 2,Nuclear receptor coactivator 2,NCOA2)、RXR-α(类视黄醇 X 受体-α,Retinoid X Receptor-α,RXR-α)、PPAR-γ(过氧化物酶体增殖物活化受体Y,Peroxisome proliferator-activated receptor-γ,PPAR-γ)、CBP(转录因子环磷酸腺苷反应元件结合蛋白,cyclic AMP response element binding protein,CBP)和MED1(介质复杂亚基1,Mediator complex subunit 1,MED1)的蛋白质表达量。结果:1.乌头汤缓解寒性RA的关键网络靶标预测1.1构建乌头汤所含化学成分-预测靶标基因-已知RA相关基因相互作用网络。此网络包含254个节点,由乌头汤中所含五味中药、218个候选靶标和31个已知RA相关基因构成;1.2计算节点连接度、介度、紧密度和K core值四个拓扑特征值。筛选所得节点拓扑特征值大于相应中位值的即为关键节点(它们的中位值分别为5.00,0.30,8.13和4.00)。得到74个关键hub节点,其中有61个是乌头汤关键候选靶标,13个是已知抗RA靶标;2.关键节点通路富集分析:乌头汤所含化学成分-预测靶标基因-已知RA相关基因相互作用网络中关键节点显著富集于Role of PPAR-y Coactivators in Obesity and Thermogenesis,Chaperones modulate interferon Signaling Pathway和NF-κ B activation三条通路。结合前期乌头汤代谢组学研究和网络药理学分析,推测产热PPAR-y共激活因子可能是乌头汤治疗RA寒证的潜在靶点之一。3.整体实验验证3.1乌头汤能缓解CIA大鼠的关节炎严重程度:从表征上看,CIA、CIA寒性和CIA热性模型组大鼠红肿、畸形症状表现明显,乌头汤作用后可显著改善CIA寒性组大鼠的关节炎症状,具体表现为降低CIA寒性组大鼠的关节炎临床积分、肢体累计率、发病率,以及推迟首次发病时间,而对CIA热性组大鼠的症状改善情况不明显。乌头汤给药后可显著降低CIA寒性组的IgG和IgM水平,以及CIA热性大鼠血清中IgG水平;3.2乌头汤能改善CIA病证结合模型大鼠的相关指标:与空白组相比,CIA组、CIA寒性组和CIA热性组的关节表面温度和血流量显著上升,乌头汤可有效下调CIA寒性组的关节表面温度,轻微增加CIA寒性组和CIA热性组的关节血流量;3.3乌头汤对PPAR-y共激活因子产热通路中主要成分的调控作用:Western blot检测表明,与空白组相比,CIA组、CIA寒性组和CIA热性组炎症关节中NCOA1、NCOA2、RXR-α、CBP、PPAR-y和MED1六种蛋白的表达水平均显著降低,乌头汤作用后,CIA寒性组的PPAR-y、RXR-α、MED1和NCOA2蛋白表达水平呈浓度依赖性增加。中(3.75g/kg·day)、高(7.5g/kg·day)剂量的乌头汤可促进CIA寒性组中NCOA2和CBP的表达。乌头汤在CIA热性组中对六种蛋白的调节作用较对CIA寒性组的作用弱。4.体外细胞实验验证:Western blot检测表明,与空白组相比,IL-1β诱导的HFLS-RA 中 NCOA1、NCOA2、RXR-α、CBP、PPAR-γ 和 MED1 六种蛋白的表达水平均下调,乌头汤可有效升高以上六种蛋白的表达。小结:本研究通过将药物靶标预测、网络分析和实验验证相结合的方法,探讨了中医经典方剂乌头汤治疗RA寒证的网络调节机制,相关研究结论如下:(1)在本课题组前期建立起来的较完善的药物靶标预测方法的基础上,本研究构建乌头汤所含化学成分-预测靶标分子-已知RA相关基因相互作用网络,选到74个关键hub节点,其中有61个是乌头汤关键候选靶标,13个是已知抗RA靶标。通路富集分析显示,这些关键节点显著富集于Role of PPAR-γCoactivators in Obesity and Thermogenesis,Chaperones modulate interferon Signaling Pathway 和 NF-κ B activation 通路中;(2)结合前期乌头汤药效动力学和尿代谢组学研究,以及PPAR-γ共激活因子产热通路功能,发现乌头汤对寒性RA的治疗作用与其对涉及到此通路的六个关键节点(PPAR-y、NCOA1、NCOA2、MED1、RXRA 和 CREBBP)的调控有关;(3)通过实验验证,乌头汤对RA寒性的疾病改善作用较RA热性的改善作用显著,且呈剂量依赖性(1.88g/kg-7.5g/kg)。具体表现为降低CIA寒性关节炎临床积分、疾病发生率、受累关节比例,推迟首次发病时间。乌头汤给药后可显著降低CIA寒性组的IgG和IgM水平,以及CIA热性大鼠血清中IgG水平,并能降低CIA寒性组大鼠的关节表面温度,增加其关节表面血流量;(4)整体和细胞实验揭示乌头汤对CIA寒性组的PPAR-γ、NCOA1、NCOA2、MED1、RXRA和CREBBP蛋白表达水平有促进作用,而在CIA热性组中对六种蛋白的调节作用较对CIA寒性组的作用弱。结论:PPAR-γ共激活因子产热通路可能是乌头汤缓解寒性RA症状的潜在作用靶点之一。相关发现为经典名方乌头汤作用原理的了解以及科学内涵的阐述提供初步的科学依据,也为今后设计RA患者的个体化治疗方案和新药研发提供新思路和参考。